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基因治疗的成功案例及展望基因治疗，作为一项具有革命性意义的生物医学技术，已经取得了一系列令人瞩目的成功案例。
本文将从基因治疗治愈遗传疾病、癌症的基因治疗、基因编辑等方面来介绍几个成功的案例，并展望未来基因治疗的发展前景。
基因治疗的成功案例之一是治愈遗传疾病。
遗传疾病是一类由基因突变引起的疾病，如囊性纤维化、遗传性失明等。
通过基因治疗，医生们可以将正常的基因导入患者体内，纠正其体内基因突变导致的异常，达到治愈效果。
例如，在2019年，研究人员利用基因治疗成功治愈了囊性纤维化患者。
他们将正常的囊性纤维化转运子基因导入患者肺部细胞中，并恢复了其正常功能。
这为遗传疾病的治愈提供了希望，并且为其他类似疾病的基因治疗研究奠定了基础。
另一个成功的案例是基因治疗在癌症治疗中的应用。
癌症是全球范围内令人担忧的疾病，而传统的治疗方法如化疗、放疗往往带来严重的副作用。
基因治疗为癌症治疗带来了全新的思路。
例如，在2017年，美国食品药品监督管理局批准了Kymriah（tisagenlecleucel）这一CAR-T细胞疗法。
该疗法通过提取患者的免疫细胞，在实验室中进行基因修饰，使其具备识别和消灭癌细胞的能力，然后再将这些修饰后的细胞重新注入患者体内，以达到治疗癌症的效果。
这一疗法在治疗儿童急性淋巴细胞性白血病方面取得了令人瞩目的成功。
至今，CAR-T细胞疗法已获得多个国家的批准，在治疗其他癌症类型方面也取得了许多进展。
此外，基因编辑作为一种新兴的基因治疗技术，也显示出了巨大的潜力。
基因编辑通过CRISPR-Cas9等技术，可以对基因组进行精确的编辑和修复，从而实现对疾病致病基因的精准修饰。
例如，在2018年，中国科学家使用CRISPR-Cas9技术成功治疗了一例艾滋病病毒感染的患者。
他们通过基因编辑剔除了患者体内的艾滋病毒受体基因，使其免受病毒感染。
这一成果再次证明了基因编辑在治疗传染性疾病方面的巨大潜力，将为传染性疾病的治愈提供新的途径。
第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8 对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD 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271BIOTECHWORLD 生物技术世界为什么人类这个物种会进化出像ΨGULO基因失活这样如此严重的遗传缺陷,而且涉及到整个全人类呢？笔者认为,大约在四十亿年前,刚刚诞生的生命最初形式会合成自己所需要的所有维生素,但后来有些物种开始依赖于别的物种以获取维生素,久而久之就失去了这种合成能力。
获取维生素成为这些物种生活必不可少的一部分,并创造了一种独特的复杂有机分子流通形式,科学家将这种方式命名为“维生素的传递”。
研究发现那些生活于1亿年前的哺乳动物祖先,是从来不会患上坏血病的,它们能够自己合成L-抗坏血酸。
我们人类的祖先灵长类动物生活在树上,早就开始食用果实和树叶等L-抗坏血酸含量十分丰富的食物, L-抗坏血酸这种维生素对于我们的祖先来说食物中并不匮乏,相反,每天从食物中摄入的量往往是身体需求量的10-50倍,而维持合成L-抗坏血酸的GULO基因的活性又会额外地消耗大量的供能物质葡萄糖。
因此,在自然选择的压力下,人类和灵长类动物的共同祖先大约在5800万年前开始演化,逐渐丧失了这种独立合成L-抗坏血酸的能力。
而有些学者提出了凝问:对于人类不能自身合成L-抗坏血酸遗传缺陷,应该是数千万年前的事情,人类早就已经适应了。
笔者认为,由于ΨGULO基因突变,人类丧失了自身合成L-抗坏血酸的能力,因此,在自然选择的压力下,人类确实已经逐渐地演化出以下五项补救能力。
1 机体保存L-抗坏血酸的能力有所提升研究显示,L-抗坏血酸在人类体内的半衰期比大鼠和小鼠要长几个等级。
丧失了制造L-抗坏血酸能力的人类祖先,如果不能提升保存L-抗坏血酸的能力,必然面临更大的生存挑战。
但是,即使如此,人类L-抗坏血酸储池的水平仍然大大低于绝大多数动物,还是人类的第一生理“软肋”。
2 人类身体有一道特有的限铁机制铁是细菌生存和繁殖不可或缺的营养元素,因此,限铁可以阻止细菌繁衍。
限铁机制是人类特有的,多数哺乳类动物都没有限铁机制,而这些哺乳类动物恰恰都是在体内可以制造L-抗坏血酸的。
《CRISPR-Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点整合的研究》篇一CRISPR-Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点整合的研究一、引言随着生物技术的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物学研究的重要工具。
其中，CRISPR/Cas9系统因其高效、精准的特性，在动物模型、基因治疗及农业生物技术等多个领域发挥着日益重要的作用。
本研究关注的是，如何通过CRISPR/Cas9技术将血管内皮生长因子（VEGF）基因定点整合至绒山羊基因组中，以期在医学和农业领域获得潜在的应用价值。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的绒山羊均来自本地的养殖场，并经过伦理委员会的批准。
实验所使用的CRISPR/Cas9系统试剂及其他分子生物学相关试剂均购买自国内外知名供应商。
2. 方法（1）VEGF基因的克隆与表达分析：首先，通过PCR技术克隆VEGF基因，并对其表达水平进行检测，以确定其作为研究对象的适用性。
（2）CRISPR/Cas9系统设计与构建：根据绒山羊基因组的特点，设计CRISPR/Cas9系统并构建相应载体。
（3）绒山羊基因编辑：将构建好的CRISPR/Cas9系统载体通过特定方法导入绒山羊的细胞中，实现VEGF基因的定点整合。
（4）编辑效果检测：通过PCR、测序等方法检测VEGF基因的整合情况及表达水平。
三、实验结果1. VEGF基因的克隆与表达分析通过PCR技术成功克隆了VEGF基因，并对其表达水平进行了检测。
结果显示，VEGF基因在绒山羊组织中表达活跃，具有良好的研究潜力。
2. CRISPR/Cas9系统设计与构建根据绒山羊基因组的特点，成功设计了CRISPR/Cas9系统并构建了相应载体。
该系统具有较高的特异性及效率，为后续的基因编辑提供了有力保障。
3. 绒山羊基因编辑及编辑效果检测将构建好的CRISPR/Cas9系统载体导入绒山羊的细胞中，实现了VEGF基因的定点整合。
通过PCR、测序等方法检测，发现VEGF基因已成功整合至绒山羊基因组中，且表达水平有所提高。
浅谈基因治疗的优势和缺陷【摘要】生物基因治疗是一种新兴的、具有显着疗效的肿瘤治疗模式，生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。
与传统的治疗方法不同，生物治疗主要是调动人体的天然抗癌能力，恢复机体内环境的平衡，相当于中医的“扶正培本，调和阴阳”，是一种自身免疫抗癌的国际最新治疗方法。
对于患有肿瘤的病人来说，这无疑是一大喜讯。
【关键词】DNA 基因治疗优势缺陷基因治疗是运用生物分子学技术和细胞工程技术对中晚期肿瘤和转移、复发实体瘤患者（包括肝癌、淋巴癌、乳腺癌、肠癌等恶性肿瘤），在CT和B超精准定位下，对实体瘤进行有效地生物免疫冲击，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异味性效应细胞和分子，让实体瘤缩小甚至消失，迅速使肿瘤各项指标下降或恢复正常，达到最终清除癌症的目的。
要真正正确地从基因的角度对肿瘤进行治疗，我们必须得先清楚基因的结构特征，当然，人类为此也付出了很多辛勤的汗水。
一、什么是基因基因是具有遗传效应的DNA片段。
那什么又是DNA呢？DNA（为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。
DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。
主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。
其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。
带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现。
二、DNA的结构特点沃森和克里克两位科学巨匠提出DNA双螺旋结构，揭示了遗传信息的储存以及传递。
DNA是反向平行的右手螺旋双链结构，具有严格的碱基互补配对关系（A—T，G—C）。
从发育生物学浅谈基因疗法时间表化生学院生物系生物07本3号高阳【摘要】：10多年来，基因疗法不断在新领域取得成功，世界上已有逾千名患者进行了这方面的治疗。
基因疗法的对象现已包括血友病、严重贫血、关节炎、心血管病、癌症，甚至艾滋病等15种以上疑难顽症。
有专家估计，人类的疾病有一大半可望利用基因疗法来治疗，而且可以达到根治的效果。
随着基因疗法的发展，也带出了很多的安全隐患和伦理道德问题。
据信，随着研究的深入和基因治疗的不断完善，那些已出现或潜在的问题会逐渐解决。
正如基因治疗专家们所说，再给科学一次机会，加上科学界的共同努力、公众的理解和支持，基因疗法依然前景无限。
【关键词】;基因疗法;对象;技术障碍;安全隐患;前景今年，美、英、法、德、日、中等国科学家共同宣布，人类基因组工作草图已经绘出，人体全部基因的初步测序研究工作已经完成，科学家们将深入研究与各种疾病有关的基因、疾病基因与其他基因及环境的相互作用等。
预计到2010年或2020年，基因疗法将成为一种普通的治疗方法。
20 世纪80 年代初,随着分子遗传学的研究深入,特别是医学分子遗传学研究进展和应用, 许多遗传病的发生机理在基因水平上被揭示,这样就有可能从基因水平上去诊断和医治遗传病。
检测表明,遗传性疾病中的大多数是由于单个基因突变所引起的。
随着DNA体外重组技术的不断完善,与遗传病有关的基因不断被分离、克隆、分析,同时又由于基因转导效率的不断提高,将这些技术和理论用于人类本身就必然成为广大科学工作者所追求的目标。
因此,基因治疗的设想一经提出,便以惊人的速度发展起来。
虽然这种设想在科学界、宗教界以及社会伦理及道德法律方面产生了巨大的震动并出现了一些非议,但这并不能阻止该科技的不断深入和发展。
仅在短短的20 多年里,从理论转化为实践,从实验室走向临床, 基因疗法成为分子生物学与医用分子遗传学的结合部,现已成为多学科相互渗透的研究及技术开发热点。
那么什么是基因疗法呢？所谓基因疗法：就是采用分子遗传学技术, 以相应的正常基因去代替有缺陷的基因, 或选择地使有害基因失活，从而达到治愈疾病的目的。
基于基因疗法的可遗传新型基因疫苗技术可能和人类基因进化的协同性作者：李慧洋摘要：常规疫苗因为其免疫不具遗传效应可能对人类长期的适应能力有削弱作用。
通过向细胞嵌入处理后的抗原基因序列对人类基因组进行扩充可以产生免疫反应并有遗传效应。
同时可以扩充生物的基因组，产生人类进化的可能。
本文将介绍这一技术相关领域的新成就，并对这一尚无人研究的新技术做出展望。
关键词：基因疗法；进化；基因疫苗；免疫一、传统疫苗的缺陷和不足和新型基因疫苗的必要性不能否认免疫学为人类发展做出的巨大贡献。
疫苗的发现可谓是人类发展史上具有里程碑意义的事件。
因为人类的历史部分上看就是和自然灾害和疾病作斗争的历史。
在对疾病的抗争中。
最主要的手段是预防。
疫苗作为最有效的预防手段，对各种重大疾病的防治都获得了成功。
以牛痘疫苗为代表的一系列成功的疫苗研制和推广工作，已经灭绝了很多对人类造成极大损害的疾病。
通过这种健康保证，使劳动力得到了保障，并且促进了社会经济的快速发展。
然而,这种医学上的灵丹妙药，极大地成功保护人类发展航程的忠诚卫士，其有着无法逃脱的最终困境，并且这位卫士很有可能最后摧毁人类航行之船。
如何客观的理解、理性的应用，乃至最终脱离这种应用。
是一个重大课题。
疫苗的不足之处有以下几点。
其一，疫苗虽然对个体来说是预防的，但是却是某一重大疾病出现并造成重。
提供可能。
这一设想目前尚无科学家进行研究和论证，因为其立题之初就存在一些困难需要解决。
例如毒性，不可控性和技术上能否实现等问题。
下面列举的几种技术笔者认为可以作为可遗传基因疫苗的核心技术。
三、需要的技术和面临的若干问题一、溶原性细菌和温和噬菌体温和噬菌体是指在细菌基因转移过程中,噬菌体的外源性基因组已整合到宿主菌染色体上的噬菌体基因组，整合在细菌基因组里的噬菌体基因称为前噬菌体（prophage），带有前噬菌体基因组的细菌称溶原性细菌（lysogenic bacterium）。
这种现象的人工利用，就是基因免疫的原理。
基因疗法离我们还有多远①自1928年英国细菌学家弗莱明发现青霉素，到首次在医学上应用，花了13年时间。
基因疗法也像青霉素等药物的发现、发明一样，不可避免地经历着曲折起伏的过程。
因普通药物和传统疗法的局限性，生物制药公司从20世纪末开始把目光投向基因疗法。
近年来，基因疗法更成为业内热门的领域之一，因为它很可能成为癌症的终结者。
②人类的许多疾病，包括癌症，都是由我们身体细胞内的基因缺陷造成的。
就像盖房子必须要依赖图纸一样，构建我们复杂的躯体，也需要各种“图纸”，这就是基因蓝图。
它们允许细胞制造出相应的蛋白质，这些蛋白质再来控制应有的功能。
如果基因发生突变，蛋白质就会随之改变，不再按照正常的方式工作。
而基因疗法，就是试图通过修补失效的基因，达到治愈疾病的目的。
③基因疗法目前还处在“物以稀为贵”的时期。
最典型的案例是，2015年德国医生伊丽莎白?泰森为病人做了脂蛋白脂酶缺乏症的基因治疗，疗效很好，但十分昂贵——一次治疗就花费了一百万美元，而且这种疗法仅针对一个人，只使用一次，成本非常高。
④基因疗法对遗传病的治疗有着巨大的潜力，可以预测，不久的将来，一定会有更多的疗法向公众开放。
2016年4月，欧洲部分国家为一些修复免疫系统的基因疗法开了“绿灯”。
2017年，治疗失明的基因疗法也将在美国通过商业许可。
⑤不过，基因疗法的风险还是很大的。
据行业杂志《基因工程与生物技术新闻》报道，前不久，就有三位患脑瘤的病人因服用基因试验药物而相继死亡。
无可罝疑，任何一种成熟可靠的药物或治疗手段都需要经过一代、几代人的努力，甚至是以很多生命的代价换来的。
我们热切期盼着安全、廉价的基因疗法能早日造福人类。
（选自《知识就是力量》，略有删改）1.下面对本文说明的主要内咨，概括最准确的一项是（??? ）A.甚因疗法离我们还很遥远B.基因疗法与癌症的关系C.基因疗法临床治疗的风险D.基因疗法的治疗原理与应用探索2.下面对说明方法及其作用分析,不正确的一项（?? ）A.第①向然段运用作比较的说明方法，说明基因疗法也像青霉素一样会很快应用于临床实践。
基因治疗药物的有效性评估与临床结果分析基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新兴领域。
随着基因治疗药物研发的不断发展，它已经在某些疾病的治疗中取得了一些令人振奋的临床结果。
本文将对基因治疗药物的有效性评估与临床结果进行分析。
基因治疗药物是通过转运外源基因至患者体内，以修复或替代功能缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。
其疗效评估一般包括实验室研究、体内外试验以及临床试验。
在实验室研究阶段，基因治疗药物的有效性主要通过体外细胞实验来评估。
研究人员通过基因转染技术将治疗基因导入目标细胞，并观察其对细胞功能的影响。
例如，在肿瘤治疗中，研究人员将抗肿瘤基因导入肿瘤细胞中，并观察其对肿瘤生长和扩散的抑制效果。
这些实验结果可以为基因治疗的进一步临床应用提供重要的参考依据。
体内外试验是在动物模型中进行的。
研究人员使用基因转运技术将治疗基因导入动物体内，并评估其对疾病模型的治疗效果。
这些试验可以模拟真实疾病环境，评估基因治疗药物的安全性和有效性。
例如，在遗传性疾病的治疗中，研究人员将治疗基因导入小鼠模型，并观察其对疾病表型的改善情况。
体内外试验的结果可以为基因治疗的进一步优化和改进提供重要的指导。
临床试验是评估基因治疗药物有效性的最重要阶段。
在临床试验中，研究人员将基因治疗药物应用于人体，观察其对疾病的治疗效果以及可能出现的不良反应。
临床试验一般分为三个阶段：I期试验评估基因治疗药物的安全性，II期试验评估药物的疗效，并进一步确定剂量与疗程，III期试验则是多中心、大样本的随机对照试验，用于证实药物的疗效和安全性。
近年来，基因治疗药物在某些疾病治疗中取得了积极的临床结果。
例如，新冠病毒疫苗采用了mRNA技术，通过携带新冠病毒的蛋白编码基因，引导人体产生相应的免疫反应。
临床试验显示，这种基因治疗药物有效预防了新冠病毒感染，降低了死亡率和疾病传播的风险。
基因治疗药物的有效性评估与临床结果分析还需要考虑一些重要因素。
