当前位置：文档之家 › 双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因

  • 格式：docx
  • 大小：16.78 KB
  • 文档页数：4

双荧光素酶报告基因

启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）

一、实验目的：分析启动子活性

二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter Assay

System（Promega）试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧

光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫

荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被

同时转染入细胞内作为内参。

三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒，

PBS，细胞裂解液，96孔，

四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪

五、实验方法及步骤：

1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；

2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；

3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase

Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；

4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；

5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。实验结 果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差

(mean±S.D.)表示。

六、注意事项

1.做好对照。

2.多做几个复孔，求平均值。

七、补充知识点

双荧光素酶报告基因实验

1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega

E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液

Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）

Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液

Dual-Glo?Stop-Glo?底物

2.报告基因的作用

细胞信号转导途径

启动子/增强子

受体结合

病毒/细胞相互作用

转录因子

药物诱导作用或“效果”

3.原理

–制备含有luc/ R luc的DNA

–转染

–提供刺激

–测量荧光

–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化

归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)

4.载体- 萤火虫萤光素酶载体

pGL3 家族

pGL3-Basic pGL3-Control

pGL3-Enhancer

pGL3-Promoter

海肾萤光素酶报告基因载体

pRL-TK

5.试剂制备

–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，

Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融

–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop

&Glo? 底物（现用现配）

–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C

两步加入试剂：加，读，加，读

6.检测步骤：

实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温

1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测

2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的

Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。例如96孔板，一般会加入75ul与孔中培养基等体积的试剂。

3.孵育至少10分钟，测萤火虫荧光值。荧光值在加入Dual-Glo?

萤光素酶试

剂后2小时之内较稳定。

4.测海肾荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与开始的培养基等体积的

Dual-Glo? Stop &Glo?试剂，混匀。与第二步类似，若用的是96孔板，则加入75ul试剂。

注意：Dual-Glo? Stop &Glo?试剂要在加入Dual-Glo? 萤光素酶试剂后4小时之内加入。

5.孵育至少10分钟，测海肾的荧光值。荧光值在加入Dual-Glo?

Stop &Glo? 试剂后2小时之内较稳定。

6.计算结果=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)

合集下载

双荧光素酶报告基因检测实验步骤

双荧光素酶报告基因检测实验步骤

双荧光素酶报告基因检测实验步骤

引言：

双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。

一、材料准备

1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。

2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。

3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。

4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。

5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。

二、细胞处理

1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。

2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。

3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。

三、荧光素酶检测

1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。

2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。

3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。

4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。

四、数据处理与分析

1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。

2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。

3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。

4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。

五、注意事项

1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。

双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因是一种常用的报告基因，用于研究生物体内特定基因的表达水平和转录活性。

双荧光素酶报告基因是由荧光素酶（Luciferase）和绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）两个成分组成。Luciferase是一种产生荧光的酶，能够将进入细胞内的底物荧光素氧化为荧光产物，并发射出可见光。GFP是一种随着基因表达而绿色荧光的蛋白质，可以直接通过显微镜观察到。

双荧光素酶报告基因主要通过将荧光素底物注射至细胞内来观察特定基因的表达水平。当目标基因活性高时，荧光素底物会被荧光素酶氧化产生荧光，并发射出可见光。这样可以通过荧光观察到目标基因的表达水平。同时，双荧光素酶报告基因还可以通过GFP的绿色荧光信号来观察细胞的活性，以及基因在细胞中的定位。

利用双荧光素酶报告基因可以对基因表达进行定量和定位分析，进而研究基因调控和信号转导路径等生物学过程。它在生物医学研究和药物筛选中广泛应用，为科学家们提供了一个有效的工具来研究基因功能和生物过程中的分子机制。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

导言

近年来，基因检测技术在生物医学领域的应用越发广泛，为医生们提供了更多的疾病预防和治疗的手段。其中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一项基于PCR技术，结合双荧光素酶发光原理，经过特殊的检测报告基因分析、得出结果的高新技术产品。本文将从介绍双荧光素酶报告基因检测试剂盒的技术原理、检测流程等方面进行详细阐述。

技术原理

双荧光素酶报告基因检测试剂盒采用了双荧光素酶发光原理，基于PCR技术代替了传统的差凝法、凝胶法、S-NAT等常规检测方法，新一代的检测方法具有精准、快速、高效、灵敏度高等优点。针对疑难杂症、高危人群的诊断与筛查，有着不可替代的作用。

检测流程

首先，收集患者的生物样本，包括血液、唾液等，进行DNA提取。然后，应用PCR扩增技术，将关键目标序列扩增，再进行双荧光素酶与基因序列的结合，使得复合物能够显现荧光物质。最后通过特殊的光谱仪检测荧光物质的强度，得出结果。

优势特点

本产品有着以下优势：

1. 高灵敏度：检测结果的灵敏度高，能够检测到非常微小的变化，进而提高检测结果的可靠性；

2. 高效率：检测时间短，较传统检测方法的效率大大提高，提升患者检测效率；

3. 精准度高：基于PCR技术及双荧光素酶原理，减少了人为的操作失误，提高了检测数据的精准度，有助于医生做出更加准确的诊断；

4. 检测结果直观：光谱仪显示荧光值，结果直观，比传统检测结果，操作人员容易理解，减少了数据误解。

结语

随着科技的发展，双荧光素酶报告基因检测试剂盒作为一种高新技术产品，应用价值得到了广泛认可。其潜在的临床应用前景，将会在未来的医疗领域中起到越发广泛和重要的作用。

双荧光素酶报告基因 2

双荧光素酶报告基因 2

双荧光素酶报告基因

启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）

一、实验目的：分析启动子活性

二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter Assay

System（Promega）试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧

光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫

荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被

同时转染入细胞内作为内参。

三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒，

PBS，细胞裂解液，96孔，

四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪

五、实验方法及步骤：

1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；

2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；

3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase

Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；

4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；

5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。实验结 果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差

(mean±S.D.)表示。

六、注意事项

1.做好对照。

2.多做几个复孔，求平均值。

七、补充知识点

双荧光素酶报告基因实验

1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega