分离纯化蛋白质的方法及原理

实用标准文案

精彩文档 （二）利用溶解度差别

影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。

1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。

盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。

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1 分离纯化蛋白质的方法及原理

（一）利用分子大小

1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。

方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行

涉及的问题：

如何加快透析过程

（1） 加大浓度差，及时更换透析液

（2） 利用磁力搅拌器

常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成

2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上

3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。

结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来

（二）利用溶解度差别

4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。

5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析 ……………………………………………………………最新资料推荐…………………………………………………

2 （三）根据电荷不同

6、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

２０１２年１月５日第２ｌ卷第１期　Ｖｏ１．２１，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａ￣５，２０１２　中ｌ　茄　

Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　・药学专论・　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ＃ｃａｌ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　

蛋白质分离纯化方法研究进展　

吴少辉，刘光明　

（大理学院药学院，云南大理６７１０００）　

摘要：蛋白质是生物体内含量最高、功能最重要的生物犬分子，其分离纯化方法已成为目前的研究热点之一。该文依据蛋白质的物理、化学　

和生物学特性，从蛋白质分子的大小、溶解度、电荷性质等方面，同时结合高效液相色谱法在蛋白质分离纯化中的应用，对其进行了综述。　

关键词：蛋白质；分离；纯化；进展　

中图分类号：ＴＱ４６０．６；Ｒ９７７．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２０１２）０１—０００１—０３　

Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

Ｗｕ　Ｓｈａｏｈｕｉ，Ｌｉｕ　Ｇｕａｎｇｍｉｎｇ　

ｆ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｄａｌｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ　６７１０００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｙｉ￣ｌｏ，ｉｔｓ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｆｉｆｉｃａ—　

ｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｂｅｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ｈｏｔ　ｓｐｏｔ　ｏｆ　ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｖｉｅｗ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ　ｔｈｅ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｉｚｅｓ，ｄｉｓｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　

ｃｈａｒｇｅ，ｅｔｃ．，ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　

蛋白质分离纯化的技术

前言

蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。

一、蛋白质分离的基本原理

蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。

二、蛋白质分离纯化技术的分类

根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：

1. 分子筛层析：

分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。

2. 表面等电聚焦（IEF）：

表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。

3. 亲和层析：

亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。

4. 透析：

透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。这种方法适用性较广，可以扩大分子分离的范围。