血球计数板及其使用方法

关于“使用血球计数板对酵母菌进行计数”的问题探讨

摘要：“培养液中酵母菌种群数量的动态变化”是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，需要学生学会使用血球计数板进行准确计数酵母。通过结合“培养液中酵母菌种群数量的动态变化”这一实验和有关血球计数板的命题的分析，对血球计数板的计数原理和操作方法中遇到一些问题进行探讨。

在人教版高中生物教材中，“探究培养液中酵母菌种群数量变化”只作了基本的原则性指导，对一些操作过程的细节，没有作细化阐述，而这些细节都是实验成功的关键所在。

如何正确使用血球计数板对酵母菌种群数量进行计数，是本实验的重点和难点。根据中学实验条件，用显微镜直接计数法相对容易，只要指导学生掌握血球计数板的正确使用便可。但学生对血球计数板结构的认识不够明确，教师也讲解不清晰。而在近年来的高考题或模拟题中多次出现相关的试题，而且不仅从如何计算酵母的数量的角度来考查学生，还从操作方法或操作过程中出现的一些问题以及处理方法来考查学生。而教师在遇到这些问题往往让学生记答案，学生对这些问题仍是感到疑惑。笔者在近年来的教学实践中，将教师和学生在做该实验和相关命题遇到的一些问题，进行了分析探讨。

1 血球计数板的构造和计数原理

虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mmx2mmx0.1mm方格，苏教版推荐使用1mmx1mmx0.1mm方格，但是血球计数板的使用原理和方法是相同的。以下以1mmx1mmx0.1mm方格的计数板为例分析结构和计数原理。

每个血球计数板上有两个计数室（图1）。血球计数板上的符号和数字（图1）的含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板中计数室分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2（计数室边长1mm），分400个小格，每小格面积是1/400mm2（图2），9个大方格中只有中间的有小方格的中央大方格才是计数室。不要认为9个大方格都是计数室。

血球计数板介绍

用优质厚玻璃制成。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm.容积为0.1mm（ul），其中，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单线划分为16个小方格。四角的4个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为16个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定，大方格每边长度允许误差为±1%。

使用方法

1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。

2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3个。

1 关于血球计数板的使用及问题讨论

《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，该实验通过探究培养液中酵母菌种群数量的变化，尝试建构种群增长的数学模型并用数学模型解释种群数量的变化，说明制约种群个体数量变化的种群外部环境因素和种群内部因素。

在该实验中，需要测定酵母菌细胞数量。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等，教材采用的是较为简便、快速、直观的显微镜直接计数法。因此，学会使用血球计数板进行准确计数，是该实验成功与否的关键。

虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mm×2mm×0.1mm方格，苏教版推荐使用1mm×1mm×0.1mm方格，但是血球计数板的使用原理和方法是相同的。笔者通过近年来对该实验的摸索，对血球计数板的使用和命题方面存在的一些问题进行了分析总结。

一、血球计数板的使用原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。

血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板；大方格的长和宽各2mm，深度为0.1mm，其容积为0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。

精品文档

. 细胞数的测定

一、目的与要求

了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。

二、原理

用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25×16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3

三、血球计数板的使用方法

（一）菌悬液的制备 为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5～10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。

（二）加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 精品文档

. （三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。当芽孢菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。

（四）计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。每小格中菌数以5-10个为宜，如菌液过浓可适当稀释。