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犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【摘要】In this paper, the factors affecting the development of canine oocytes in vivo and in vitro maturation are reviewed, and its culture methods are summarized in order to provide a theoretical basis for overcoming the obstacles of canine related assisted reproductive technology and protecting precious and endangered species.%本文就犬卵母细胞体内发育及体外成熟的影响因素进行综述, 并对其培养方法进行了总结, 以期为克服犬相关辅助生殖技术的障碍, 保护珍贵和濒危犬种提供理论基础.【期刊名称】《特产研究》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】6页(P109-114)【关键词】犬;卵母细胞;体内发育;体外成熟【作者】曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【作者单位】中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;吉林农业大学,长春 130118【正文语种】中文【中图分类】Q954.42犬科动物多为季节性、单次发情动物，但经驯养的家犬，其季节性发情特点逐渐消失，全年均可出现发情，尤其春、秋季节的发情比例较高[1]。
试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。
1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。
1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。
1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
《外源谷胱甘肽促进绵羊卵母细胞体外发育及其改善砷暴露后发育异常的研究》篇一一、引言随着畜牧业的快速发展，绵羊的繁殖效率及胚胎质量已成为养殖业的重要关注点。
然而，环境污染物如砷等重金属元素对绵羊生殖系统的影响日益凸显，导致卵母细胞发育异常，进而影响胚胎质量和繁殖效率。
谷胱甘肽作为一种重要的生物活性物质，具有抗氧化、抗凋亡等作用，其在促进卵母细胞体外发育方面具有巨大潜力。
本研究旨在探讨外源谷胱甘肽对绵羊卵母细胞体外发育的促进作用及其在砷暴露后改善发育异常的效果。
二、材料与方法1. 材料实验所用绵羊卵母细胞、培养基及其他试剂均采购自专业供应商。
砷暴露实验中使用的砷化合物及其浓度根据相关文献设定。
2. 方法（1）卵母细胞采集与处理：从健康成年绵羊卵巢中采集卵母细胞，进行体外成熟培养。
（2）实验分组：将卵母细胞分为对照组、谷胱甘肽处理组和砷暴露组，以及谷胱甘肽预处理后砷暴露组。
（3）培养与观察：在设定条件下进行体外培养，观察并记录各组卵母细胞的发育情况。
（4）数据分析：采用统计学方法对实验数据进行处理和分析。
三、实验结果1. 谷胱甘肽对绵羊卵母细胞体外发育的促进作用实验结果显示，外源谷胱甘肽处理组的卵母细胞在体外发育过程中的成熟率、受精率及胚胎发育率均显著高于对照组，表明谷胱甘肽对绵羊卵母细胞的体外发育具有显著的促进作用。
2. 砷暴露对绵羊卵母细胞发育的影响砷暴露组的卵母细胞在体外发育过程中出现明显的发育异常，包括成熟率降低、受精障碍及胚胎发育受阻等。
这表明砷暴露对绵羊卵母细胞的发育具有显著的负面影响。
3. 谷胱甘肽对砷暴露后卵母细胞发育异常的改善作用谷胱甘肽预处理后砷暴露组的卵母细胞在体外发育过程中的各项指标均有所改善，与砷暴露组相比，成熟率、受精率及胚胎发育率均有显著提高，表明谷胱甘肽具有改善砷暴露后卵母细胞发育异常的作用。
四、讨论本研究结果表明，外源谷胱甘肽能够显著促进绵羊卵母细胞的体外发育，提高其成熟率、受精率及胚胎发育率。
绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展王中伟，岳顺利，周佳勃∗东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨（150030）E-mail:wzw006336@摘要：本文介绍当前在绵羊和山羊卵母细胞采集和体外成熟方面的研究进展。
卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量。
卵母细胞采集方法分为从死亡动物和活体采卵两大类。
死亡动物采卵主要有抽吸法和切割法。
缺点是得到的是不同发育阶段的卵母细胞，而且要牺牲供体的生命。
先进的活体采卵技术有两种分别是腹腔镜采卵和超声波引导阴道穿刺采卵。
它们优点是对母羊损伤小、利用率高。
卵母细胞冷冻保存有助于提高优质卵母细胞的利用率。
最后还阐述了影响卵母细胞质量和产量的因素，例如，激素、血清、卵泡液、生长因子等一些因素的作用。
关键词：绵羊，山羊，卵母细胞，采卵，体外成熟中图分类号：S8111 引言中国养羊业历史悠久，绵羊和山羊品种多样，羊产品也十分丰富。
绵羊和山羊不但具有经济价值，而且可以作为许多疾病研究的很好的实验动物模型。
近些年，国内外在家畜生殖技术研究，特别是在绵羊和山羊的生殖技术方面取得了很大进展，例如第一个体细胞核移植成功的动物就是绵羊。
此外，这些应用在绵羊和山羊上的生殖技术还可用于保护野生濒临灭绝的小型反刍动物[1]。
众所周知，卵母细胞体外成熟（IVM）是进行体外胚胎生产（IVP）、克隆以及辅助生殖（ART）的基础。
本文介绍了目前绵羊和山羊卵母细胞成熟技术的研究进展和影响因素。
2 卵母细胞的采集和保存2.1采集前的促性腺激素处理绵羊或者山羊卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量，性未成熟羔羊经促性腺激素处理后也可做为供体[2]。
研究表明，促性腺激素处理羔羊得到的卵母细胞数量高于同样处理的成年山羊，但是二者卵母细胞的体外发育的情况却相似[3]。
绵羊经FSH处理两天得到的卵母细胞的回收率和卵裂率大于处理三天。
在绵羊同步发情实验中发现，恒定剂量处理比递减剂量FSH处理获得的卵母细胞质量更好而且对冷冻保存的耐受能力更强[4]。
未成熟人卵母细胞体外成熟的临床应用进展徐玉萍【摘要】未成熟人卵母细胞体外成熟(IVM)具有治疗简单、药物使用少,减轻患者经济负担、避免卵巢过度刺激等优点,是治疗不孕症的新手段,也为赠卵以及女性生育力保存提供了新的途径,已成为生殖医学领域日益热门和关注的课题.综述目前IVMI临床应用范围、应用的安全性、IVM的临床妊娠率,并展望其发展前景.【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》【年(卷),期】2011(030)005【总页数】4页(P380-383)【关键词】多囊卵巢综合征;卵母细胞;卵巢;妊娠;治疗【作者】徐玉萍【作者单位】230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心【正文语种】中文近年来，随着辅助生殖技术（ART）的广泛开展，相应并发症的发病率逐渐增高，如卵巢过度刺激综合征（OHSS）及妇科肿瘤等，而同时仍有一部分不孕症患者由于卵巢低反应或卵母细胞成熟障碍等原因不能获得优质的成熟卵子，因而不能妊娠。
一方面是要求不断减少促性腺激素对卵巢的刺激，另一方面是要求获得优质的成熟卵子，这就要求未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）技术必须不断提高并得到广泛应用。
而早在1939年，Pincus和Saunders证实人未成熟卵母细胞在体外能自发成熟，1969年Edwards进一步发现人体外成熟卵母细胞能完成体外受精[1]。
1983年人类卵母细胞的首例IVM婴儿成功诞生[2]。
从此IVM作为ART中的一项前沿技术，越来越多地被应用于临床，减少了促性腺激素的使用，帮助了卵母细胞成熟障碍的患者获得妊娠。
对难治性PCOS不孕患者可采用ART，且行体外受精（IVF）治疗时，其获卵数较多，临床妊娠率亦与其他因素不孕者相当，但OHSS发生率较高，减少IVF中卵泡刺激素（FSH）使用量可降低OHSS发生危险，但部分PCOS患者对低剂量FSH无反应或反应很轻，不能达到辅助生育的目的。
传统的IVF-胚胎移植（ET）虽然是治疗PCOS的有效手段之一，但目前临床上尚无有效的手段避免卵巢刺激过程中出现的OHSS。
2023年第07期D O I:10.3969/J.I SSN.1671-6027.2023.07.044牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下,人为创造母牛体内繁殖条件,在牛体外完成精卵结合,培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段,将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术,在牛繁殖领域应用普遍,涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断,牛精子的筛选、获能,以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究,最终达到获取高质量胚胎的目的,助力于养牛业的高质量发展。
1牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1.1采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下:(1)直接采集成熟的卵母细胞,采用超排技术从动物的输卵管采集,但不适用于牛这种大型动物;(2)活体采卵,选择繁殖性能优秀的母牛,借助腹腔镜直接采集,对采集母牛的繁殖性能影响较小;(3)从屠宰场获取,宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低,可大批量采集。
1.1.2采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后,将其放入保温瓶中,瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素,温度大约是30℃,用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1h内完成卵泡的收集,在实验室环境下,使用生理盐水清洗干净牛卵巢,然后使用注射器直接吸取卵泡,获取卵泡液,准备进行体外成熟培养。
使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养,将筛选出的卵母细胞放入培养液中,培养液中含有17-E2的中央记忆型T细胞1.5μg/m L;胎牛血清10%,促黄体生成素20%;卵泡刺激素20μg/m L。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中,温度调整至38~39℃,气象条件为5%的CO2,培养时间22~24h,需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况,适当延长1~2h,但不可超过26h,一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
在培养24h后进行牛卵母细胞的成熟检查,当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
实验九卵母细胞的体外成熟培养一、目的和要求随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入、动物克隆等胚胎工程技术的快速发展,对卵母细胞的需求量日益增加。
仅靠超数排卵技术已不能满足这类科研的需要。
因此,屠宰场的卵巢成为了当前获得卵母细胞与胚胎的重要原材料、卵巢卵母细胞体外成熟获取大量的成熟卵母细胞。
通过本实验要求掌握卵母细胞体外成熟培养的方法。
二、材料和仪器设备二氧化碳培养箱、矿物油、丙酮酸钠、链霉素、青霉素、新生犊牛血清(NCS)、17β-E2、Hepes、实体显微镜、恒温水浴锅、M199培养液、生理盐水、捡卵器、灭菌吸水纸、5 mL注射器、12号针头、PBSS、切割刀、8cm的培养皿、眼科剪、离心管等。
三、操作步骤1.成熟培养液的制备：M199+10%NCS+1～2mg/L17β-E2+10mmol/LHepes+0.12 mg/mL丙酮酸钠+双抗(0.1 mg/mL链霉素和0.125 mg/mL青霉素)。
2.卵巢采集：兔子剖腹后,立即无菌采集卵巢,除去多余脂肪组织,灭菌吸水纸擦干,置于25～29℃或30～37℃灭菌生理盐水(添加少量抗菌素)中保存,6 h以内送回实验室。
3.卵巢表面卵泡(直径:2～6 mm)卵母细胞的采集：30℃左右生理盐水洗卵巢3次后,用5 mL 注射器和12号针头及少量PBSS，先吸少量PBSS溶液,然后抽吸卵巢表面2～6 mm卵泡,抽吸液注入灭菌的10 mL离心管中,静置5 min,弃上清液并镜检回收A、B级卵丘-卵母细胞复合体。
4.机械破碎法收集卵母细胞：将采过表面卵泡的卵巢从门部纵切为两半,去除黄体、髓质和多余的脂肪组织,置于直径为8cm无菌的培养皿中,用眼科剪在表面皿内剪碎卵巢皮质(直径<0.5mm)，之后,将碎组织置于另一培养皿进行冲洗和静置。
如此反复三次,得四皿冲卵液,从中检出颗粒细胞一卵母细胞复合体。
5.卵母细胞的筛选：将两种方法所得的卵泡液分别置于无菌的捡卵杯内,静置后在体视显微镜下捡卵。
实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。
二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。
2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。
三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。
应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。
将母兔背朝下方固定于兔手术台上。
在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。
然后盖上创巾并固定。
用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。
打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。
与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。
仔细观察卵巢的变化。
记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。
先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。
从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。
人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。
卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。
分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。
（二）卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。
