哺乳动物卵母细胞成熟相关因子研究

哺乳动物生殖系统的分子调控机制研究哺乳动物生殖系统的正常发育和功能受到复杂的分子调控机制的影响，包括激素、细胞因子、信号转导通路等多种因素。

这些因素参与在精子和卵子生成、排出和受精过程中，以及胚胎着床、胚胎早期发育、性成熟以及生殖周期等各个方面。

本文将重点介绍几种重要的信号通路和关键分子，在哺乳动物生殖系统中发挥重要作用的机理和研究进展。

激素调控激素是哺乳动物生殖系统中重要的调控因素，包括促性腺激素（GnRH）、促卵泡素（FSH）、黄体生成素（LH）等，在雌性和雄性生殖系统中均起到关键作用。

GnRH 是促性腺激素释放激素，是垂体前叶释放促性腺激素的重要调节因子。

GnRH 受体（GnRHR）是局部调节促性激素合成和释放的重要分子，它的表达水平与生殖周期、排卵和受孕机会等密切相关。

其中，在雌性动物中存在两种GnRHR亚型（GnRHR1 和 GnRHR2），并在卵巢和子宫等组织中表达。

目前的研究发现，GnRHR 参与了雌性生殖系统中多种重要生理过程，如卵泡发育、卵巢周期与黄体形成等。

而在雄性生殖系统中，GnRHR 在精子发生中也发挥作用。

除此之外，FSH 和 LH 是垂体前叶的两种重要的促性腺激素。

它们被释放后可以刺激卵巢和睾丸的细胞分化和成熟，从而参与生殖细胞生成和调控。

这些激素通过 G 蛋白偶联的受体介导信号传导，激活下游分子的转录因子，这些传递下来的信号通路为了研究生殖细胞发育有着重要意义。

信号转导在激素作用的基础上，细胞内外的信号传导过程也对哺乳动物生殖发育起到至关重要的作用。

其中，细胞膜上的受体包括 G 型蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体等，如上述的GnRHR 就属于前者。

G 型蛋白偶联受体活化后，由GTP 与其结合，从而激活腺苷酸酶（AC）、磷脂酰肌醇（PI）3-激酶、蛋白激酶C（PKC）等信号分子，最终促进生殖细胞发育。

而另一类受体-酪氨酸激酶受体，则能够启动一条tyrosine kinase（TK）的信号通路。

动物医学进展,２０２０,４１(４):１１０Ｇ１１４P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y Me d i c i n e 内质网应激对哺乳动物卵母细胞成熟的影响研究进展㊀收稿日期:２０１９Ｇ０５Ｇ０５㊀作者简介:贾甜甜(１９９２－),女,陕西渭南人,硕士研究生,主要从事动物胚胎研究.∗通讯作者贾甜甜,文㊀扬,高蕾蕾,王丽丽,袁一田,雷安民∗(西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心,陕西杨凌７１２１００)㊀㊀摘㊀要:在卵母细胞成熟过程中以及胚胎着床前,具备特定功能的各类蛋白质必须在内质网(e n d o pl a s Ｇm i c r e t i c u l u m ,E R )中完成折叠与修饰,这对于维持卵母细胞成熟和胚胎发育是至关重要的.然而,外界不良因素的刺激会破坏内质网功能,阻碍蛋白质合成,诱发E R 应激和未折叠蛋白反应(u n f o l d e d p r o t e i nr e Ｇs po n s e ,U P R ),适当的应激反应有利于细胞恢复功能.卵母细胞和早期胚胎对各类外源刺激高度敏感,多项研究表明E R 应激和U P R 信号影响卵母细胞成熟和胚胎着床前发育.论文总结了E R 应激㊁U P R 信号通路及其在哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎着床前发育中的作用和机制的现状,以期为卵母细胞体外发育成熟及人类生殖临床提供借鉴.㊀㊀关键词:卵母细胞;内质网应激;未折叠蛋白反应中图分类号:S ８５２．２文献标识码:A文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０２０)０４Ｇ０１１０Ｇ０５㊀㊀对于真核生物而言,生命活动的正常进行归功于细胞之间流畅的信息交流,某些信息交流需要通过受体结合方式实现,包括可溶性配体(各类激素和递质)和细胞表面分子(受体和黏附因子),其化学本质一般为蛋白质,未经修饰的蛋白质都需要在E R 的膜状网络上进行成熟修饰,折叠成具有特定生物学功能的三维结构,才能向高尔基体转运[１].E R 包含大约一半的总膜面积和三分之一新翻译的蛋白质,通过细胞互作的方式,向其他细胞器转运脂质㊁蛋白㊁钙离子等,其结构和功能的完善对于细胞是必需的[２].然而在外界不良因素刺激下,E R 腔中错误折叠或未折叠蛋白发生积累,这会破坏E R 稳态并诱发E R 应激[３]和未折叠蛋白反应(U P R ),其主要目的是恢复该细胞器的生理活性[４].根据其诱发原因的不同,E R 应激可分为３种类型:①U P R ,这是由于蛋白质未折叠或者错误折叠,在E R 腔内蓄积而引发的,实际上,如不特别说明,大多数的E R 应激指的就是U P R ;②内质网超负荷反应(e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m o v e r l o a d r e s po n s e ,E O R ),大量已经正确折叠的蛋白质未能及时输送驻留于E R 腔内,造成细胞核因子κB (N F ＧκB )被激活;③胆固醇缺乏引发的固醇调节元件结合蛋白质(s t e Ｇr o l Ｇr e g u l a t o r y e l e m e n t b i n d i n gpr o t e i n s ,S R E B P )通路调节的反应[５].在正常生理状态下,未折叠和错误折叠的蛋白质通过E R 相关降解(E R Ｇa s s o c i a t e dd e gr a d a t i o n ,E R A D )系统和细胞质蛋白酶体去除.E R 应激时,E R 可以通过减少蛋白质的合成以及加快未折叠蛋白的处理来缓解细胞内外因素对于E R 的破坏,使其恢复生物学功能.通常主要通过３种途径实现:①U P R ,通过此方式增强E R 对多肽的折叠以及加工能力;②激活蛋白酶体依赖性E R 相关降解(E R A D ),以从E R 中去除蛋白质[６];③控制蛋白质翻译以调节多肽进入E R 的总量.通常这套反应能够成功恢复E R 稳态.然而,当E R 应激持久或过于严重的情况下,细胞将会发生凋亡[７].新蛋白质的合成对于卵母细胞成熟以及随后的胚胎发育是极为重要的.在卵母细胞成熟过程中和胚胎着床前,E R 作为蛋白质,脂质分泌和合成的主要位点,在满足卵母细胞对新蛋白质的需求中起着关键作用.这些功能性蛋白质必须在E R 中正确折叠,从而维持卵母细胞成熟和胚胎发育.卵母细胞和胚胎体外培养过程中可能会遇到各种外源性刺激,对E R 功能和蛋白质合成产生负面影响,导致E R 应激和U P R 信号通路的激活,E R 应激和U P R信号在卵母细胞减数分裂恢复和胚胎着床前发育过程中发挥关键作用,可能参与调节这些重要的生理过程[８].因此,了解E R 应激和体外发育之间的机制关系可以帮助改善卵母细胞成熟和胚胎早期发育质量.本文总结了E R 应激和U P R 信号通路的有关知识,探讨了它们在哺乳动物卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中的作用.１㊀内质网应激信号通路哺乳动物细胞利用U P R应对E R稳态扰动,主要是由E R分子伴侣蛋白免疫球蛋白结合蛋白B i P (也称为葡萄糖调节蛋白７８或G R P７８)介导的,３种E R跨膜蛋白参与E R应激反应:P E R K,I R E１和A T F６.在生理状态下,当内质网蛋白折叠和加工能力与新合成的蛋白质负荷相匹配时,E R伴侣G R P７８与这些蛋白质结合.当未折叠蛋白在内质网腔中积累时,G R P７８与P E R K㊁I R E１和A T F６解离,并与未折叠的蛋白质结合,以协助其折叠[９].１．１㊀I R E１信号通路酵母中,I R E１监测E R应激,它是一种E R驻留的跨膜蛋白,具有内源性核糖核酸酶结构域.哺乳动物有I R E１p的２个同源物I R E１α和I R E１β, I R E１α在所有组织中都是可检测的,而I R E１β仅限于肠上皮.应激时,I R E１从内质网分子伴侣G R P ７８上解离下来磷酸化为I R E１p,其内切核酸酶活性被激活,对X B P１基因进行剪接.X B P１是调节U P R基因表达的主要激活因子,受Ⅱ型跨膜蛋白A T F６的调控.就E R应激反应而言,X B P１活性至关重要,它调节哺乳动物U P R中参与蛋白质折叠,分泌和降解的基因.应激时诱导X B P１转录,转录产物在I R E１p的非常规剪接下,从无活性的X B P１Ｇu 形式转变为具有活性的X B P１Ｇs.只有X B P１Ｇs可以易位至细胞核并与特定启动子元件如E R S E(E R应激反应元件)和U P R元件结合,触发U P R靶基因的激活[１０].１．２㊀A T F６信号通路A T F６是一个E RⅡ型跨膜蛋白,哺乳动物有２个A T F６同源物A T F６Ｇα和A T F６Ｇβ.在正常情况下,A T F６与E R中的G R P７８相结合,E R应激时,A T F６与G R P７８解离,从E R转移到高尔基体,在S１P(位点Ｇ１蛋白酶)与S２P(位点Ｇ２蛋白酶)切割下活化,活性A T F６移动到细胞核,在那里它诱导E R应激应答基因以及E R S EＧ１和E R S EＧ２的转录激活.U P R时A T F６的重要靶基因包括G R P７８, XB P１和C HO P(C/E B P同源蛋白)[１１].１．３㊀P E R K信号通路哺乳动物E R应激时还有一条控制蛋白质翻译的途径.这是由真核翻译起始因子真核翻译起始因子２α(e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r２a lＧp h a,e I F２α)磷酸化介导的.磷酸化的e I F２α抑制其自身的鸟嘌呤核苷酸交换因子(g u a n i n en u c l e o t i d eＧe x c h a n g e f a c t o r,G E F)从而全面降低蛋白质的翻译.哺乳动物有４种e I F２α激酶,即G C N２㊁P K R㊁H R I和P E R K,可响应各种应激刺激.所有这些激酶都能够抑制应激反应中的蛋白质翻译.P E R K是一种E R跨膜传感蛋白,是E R应激时的主要转导因子之一,由腔结构域和胞质激酶结构域组成,并且是MAM(线粒体相关内质网膜)的一个组成部分. MAM是E R和线粒体的物理和功能接触位点,其紧密堆积着包括感应氧化应激和调节细胞死亡等各种功能的蛋白质[１２].P E R K在细胞内普遍表达,与G R P７８结合存在于E R腔中.在E R应激下,P E R K 释放G R P７８并触发e I F２α的二聚化和磷酸化,导致蛋白质合成的抑制.P E R K的存在使人们认识到细胞能够调节其新蛋白质合成水平以匹配其E R折叠能力[１３].但是e I F２α磷酸化时,转录因子A T F４及其下游靶蛋白C HO P在翻译水平会上调.A T F４上调既能促进细胞存活,又能诱导细胞死亡.轻度E R应激时,A T F４通过调节参与应激反应㊁蛋白质分泌和氨基酸代谢的基因促使细胞存活.但是E R 应激不可克服时,P E R K信号通过上调A T F４和C HO P诱导细胞凋亡,可以说P E R K信号传导决定E R应激的细胞命运[１４].综上所述,为了减少在应激时E R中新蛋白质的合成,磷酸化的e I F２α抑制翻译,随后上调A T F４的表达.A T F６被高尔基体室中的S１P和S２P切割并转化为活化的A T F６,I R E１的磷酸化诱导X B P１的剪接,调节E R分子伴侣的转录.最后,重复和持久的E R应激诱导C HO P的活化促使细胞凋亡.２㊀卵母细胞中的内质网应激反应许多报道显示,G R P７８介导的３种U P R信号通路也参与卵母细胞减数分裂成熟.已经在未成熟或成熟卵母细胞中检测到E R应激标记基因A T F４㊁A T F６㊁X B P１㊁H S P A５和G R P７８.G R P７８存在于猪卵母细胞的G V㊁G V B D㊁MⅠ和MⅡ阶段.培养４４h的卵丘Ｇ卵母细胞复合物(C O C s)中G R P７８m R N A表达水平比培养２２h时显着增加.此外,相对于２２h,４４h时C O C S中的G R P７８㊁A T F４㊁p５０A T F６和C HO P的蛋白表达水平显著升高,E R 应激会导致猪卵母细胞成熟延迟,成熟过程中使用褪黑激素作为E R应激抑制剂时可以恢复猪卵母细胞成熟[１５].在小鼠G V期卵母细胞,X B P１蛋白主要定位于核内,MⅠ期定位于纺锤体微管,E R应激信号通路对小鼠卵母细胞成熟至关重要[１６].猪X B P１蛋白主要位于G V期卵母细胞细胞核中,R TＧP C R显示猪X B P１Ｇu和X B P１Ｇs的m R N A存在于１１１贾甜甜等:内质网应激对哺乳动物卵母细胞成熟的影响研究进展G V期卵母细胞中,但在MⅠ期和MⅡ期卵母细胞中仅检测到X B P１Ｇu的m R N A[１７].这表明猪X B P１可能在卵母细胞成熟中起重要作用.在山羊的卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡时,G R P７８和C HO P的表达显著上调[１８].玻璃化冷冻处理的绵羊C O C s显示E R应激标记物A T F４,A T F６,G R P７８和C HO P的m R N A的表达水平增加,表明绵羊卵母细胞冷冻保存与E R应激和U P R信号传导有关[１９].肥胖以及多囊性卵巢综合征与E R应激有关,将小鼠C O C在富含脂质的卵泡液中培养,会诱发卵母细胞E R应激,成熟率降低[２０].另外,在临床上大剂量注射激素会导致E R应激,造成内质网聚集体S E R C的发生,这会降低卵母细胞核和胞质的成熟,造成形态异常的卵母细胞,影响受精及胚胎发育成熟[２１].这些结果表明E R应激和U P R信号传导在哺乳动物卵母细胞中存在的,并且它们对于卵母细胞发育成熟以及确保卵母细胞质量是必需的.３㊀早期胚胎内的内质网应激反应在小鼠中,敲除U P R相关基因对胚胎发育具有负面影响,表明E R伴侣蛋白和E R应激信号在胚胎着床前起重要作用.在小鼠１Ｇ细胞阶段发现E R应激信号,并且在囊胚期尤为丰富.在２Ｇ㊁４Ｇ㊁８Ｇ细胞,桑椹胚和囊胚期卵母细胞的胞质和核中均检测到XＧb o x结合蛋白Ｇ１(XＧb o xb i n d i n gp r o t e i nＧ１,X B P１)信号,但是核中的信号高于质中.R TＧP C R分析表明,X B P１Ｇu和X B P１Ｇs在２Ｇ细胞至囊胚期均有表达,而１Ｇ细胞期仅检测到X B P１Ｇu.在E R应激反应相关基因的分析中,在小鼠胚胎着床前的所有阶段均检测到双链R N A激活蛋白激酶样E R激酶(d o u b l eＧs t r a n d e dR N AＧa c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s eＧl i k e E Rk i n a s e,P E R K),细胞凋亡信号调节激酶１(a p o pＧt o s i s s i g n a lＧr e g u l a t i n g k i n a s e１,A S K１),激活转录因子４(a c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r４,A T F４),激活转录因子６(a c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o nf a c t o r６, A T F６),葡萄糖调节蛋白７８(g l u c o s eＧr e g u l a t e d p r oＧt e i n７８,G R P７８),C HO P,生长停滞和D N A损伤诱导基因３４(g r o w t ha r r e s tＧa n dD N A d a m a g eＧi n d u cＧi b l e g e n e３４,G A D D３４)和肌醇需求酶１(I n o s i t o lＧr eＧq u i r i n g e n z y m e１,I R E１)的m R N A.此外,还在囊胚期小鼠胚胎中检测到G R P７８㊁A T F６和P E R K相关基因的m R N A[２２].在孤雌激活的猪胚胎中,在４Ｇ细胞㊁桑椹胚和囊胚阶段检测到X B P１Ｇs和X B P１Ｇu 的m R N A,而在１Ｇ和２Ｇ细胞阶段仅发现X B P１Ｇu.４Ｇ细胞㊁桑椹胚和胚泡期㊁猪X B P１蛋白在定位于细胞核中,有证据表明E R应激诱导的X B P１剪接可能调节猪的早期胚胎基因组活化[１７].有研究通过实时定量P C R和免疫荧光技术测定X B P１和G R P７８的R N A丰度来评估早期和晚期胚胎的E R应激[２３].在水牛体外受精胚胎的囊胚期检测到E R 伴侣基因G R P７８和G R P９４的m R N A.E R应激相关的m R N A,包括G R P７８㊁E D E M㊁A T F６㊁I R E１㊁A T F４㊁C HO P和X B P１在牛体外受精胚胎中也有表达[２４],表明E R应激和U P R信号影响哺乳动物胚胎着床前发育.此外,在猪㊁牛和小鼠的卵母细胞成熟和胚胎发育过程中,将褪黑激素添加到培养基中可有效抵抗E R应激[２５Ｇ２６].牛磺熊去氧胆酸(t a u r o u r s o d e o x yＧc h o l i c a c i d,T U D C A)也已用于减轻小鼠卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的E R应激[２７],E R应激抑制剂处理可以减少E R应激,从而减少细胞凋亡,促进猪孤雌胚胎的体外发育[２８].在显微操作时添加E R 应激抑制剂,尤其是T U D C A,可以降低E R中的应激水平,从而抑制细胞损伤并增强猪体细胞核移植胚胎的体外发育[２９].在玻璃化冷冻保存的小鼠C O C s培养基中添加枸杞多糖可以减少E R应激,从而提高小鼠C O C s的成熟率和发育能力[３０].表明在体外培养过程中,可以通过减少或者消除内质网应激从而降低细胞凋亡,促进卵母细胞成熟,增强胚胎发育潜能.４㊀展望U P R信号通路对于恢复E R稳态和维持正常E R功能极其重要,当错误折叠或未折叠的蛋白质在E R腔中累积时,U P R信号通路被激活以改善E R 应激状态.卵母细胞和早期胚胎在体外培养过程中会遭受到许多不可控的外力侵袭,引发E R应激.这些应激对于卵母细胞成熟和着床前胚胎发育是不利的甚至是致命的.人类临床上高发的多囊卵巢综合症已经被证明是由于E R应激造成的病理现象,而在对女性不孕治疗上,使用过多的超排激素会导致S E R C的发生,造成卵母细胞的异常发育.作为对E R应激的适应性反应,U P R可以促进未折叠或错误折叠的蛋白质的清除,从而帮助卵母细胞去抵抗外界带来的不良影响.然而,如果错误折叠或未折叠的蛋白质持续存在且应激无法缓解时,卵母细胞将通过激活C HO P,J u nN末端激酶(J u n NＧt e rＧm i n a l k i n a s e,J N K)和C a s p a s e１２[３１]途径诱导细胞凋亡,这对于哺乳动物卵母细胞成熟和着床前胚胎发育是非常重要的[３２].此外,E R应激抑制剂T U D C A和褪黑素已被用于减轻哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的E R应激,但是褪黑激素２１１动物医学进展㊀２０２０年㊀第４１卷㊀第４期(总第３２２期)在哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎着床前对E R应激和U P R信号通路起作用的机制仍不清楚.未来仍需要继续研究E R应激和U P R信号影响哺乳动物卵母细胞成熟和着床前胚胎发育的机制,这对于哺乳动物体外受精及单精子注射技术的提高具有非常重要的指导意义.预防以及规避内质网应激是提高卵母细胞成熟率与质量的有效途径,理解E R应激与体外发育之间的机制关系可以有效改善人类体外辅助生殖技术水平,为人类生殖临床提供借鉴.参考文献:[１]㊀C A O SS,K A U F MA N RJ．E n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s sa n d o x i d a t i v e s t r e s s i nc e l l f a t e d e c i s i o na n dh u m a nd i s e a s e[J]．A nＧt i o x i dR e d o xS i g n a l,２０１４,２１(３):３９６Ｇ４１３．[２]㊀颜㊀冰,胡俊杰．内质网相关细胞器互作的研究进展[J]．中国细胞生物学学报,２０１９,４１(２):１７５Ｇ１８４．[３]㊀P A R KJY,K I M J W,e ta l．M e l a t o n i ni m p r o v e st h e m e i o t i c m a t u r a t i o no f p o r c i n eo o c y t e sb y r e d u c i n g e n d o p l a s m i c r e t i c uＧl u ms t r e s s d u r i n g i nv i t r om a t u r a t i o n[J]．J P i n e a lR e s,２０１８,６４(２):e１２４５８．[４]㊀K R O E G E R H,C H I A N G W C,F E L D E NJ,e t a l．E Rs t r e s s a n d u n f o l d e d p r o t e i n r e s p o n s ei n o c u l a r h e a l t h a n d d i s e a s e[J]．F E B S J,２０１８,２８６(２):３９９Ｇ４１２．[５]㊀庄㊀娟．内质网应激[J]．生物学教学,２０１２,３７(１２):２Ｇ４．[６]㊀K O N D R A T Y E V M,A V E Z O V E,S H E N KMA N M,e ta l．P E R KＧd e p e n d e n t c o m p a r t m e n t a l i z a t i 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t e i n r e s p o n s e(U P R)i nm a mm aＧl i a no o c y t e m a t u r a t i o na n d p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y od e v e l o pＧm e n t[J]．I n t JM o l S c i,２０１９,２０(２):４０９．[１２]㊀L I UZ W,Z HU H T,C H E N K L,e t a l．P r o t e i nk i n a s eR N AＧl i k e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u mk i n a s e(P E R K)s i g n a l i n gp a t h w a yp l a y s am a j o r r o l e i n r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s(R O S)Ｇm e d i a t e de n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s sＧi n d u c e d a p o p t o s i s i n d i a b e t i c c a rＧd i o m y o p a t h y[J]．C a r d i o v a s c u l a rD i a be t o l,２０１３,１２(１):１５８．[１３]㊀G I O R G IC,M I S S I R O L I S,P A T E R G N A N I S,e t a l．M i t o c h o nＧd r i aＧa s s o c i a te d m e m b r a n e s:c o m p o s i t i o n,m o l e c u l a r m e c h aＧn i s m s,a n d p h y s i o p a t h o l o g i c a l i m p l i c a t i o n s[J]．A n t i o x i dR e d o xS i g n a l,２０１５,２２(１２):９９５Ｇ１０１９．[１４]㊀L I UZ,L V Y,Z H A O N,e t a l．P r o t e i nk i n a s eRＧl i k eE Rk i n a s ea n d i t sr o l e i ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m s t r e s sＧd e c i d e dc e l l f a t e[J]．C e l lD e a t hD i s,２０１５,６(７):e１８２２．[１５]㊀P A R K HJ,P A R KJY,K I MJW,e t a l．R e g u l a t i o no f t h e e nＧd o p l a s m i c re t i c u l u ms t r e s s b y B I P/G R P７８i s i n v o l v e d i nm e iＧo t i cm a t u r a t i o no f p o r c i n eo o c y t e s i nv i t r o[J]．D e v R e p r o d,２０１７,２１(４):４０７Ｇ４１５．[１６]㊀Z H A N GJY,D I A O Y F,K I M H R,e t a l．I n h i b i t i o no f e n d oＧp l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s i m p r o v e sm o u s e e m b r y o d e v e l o p m e n t[J]．P L o SO n e,２０１２,７(７):e４０４３３．[１７]㊀Z H A N GJY,D I A O Y F,O Q A N IR K,e t a l．E f f e c to f e n d oＧp l a s m i cr e t i c u l u m s t r e s so n p o r c i n eo o c y t e m a t u r a t i o n a n dp a r t h e n o g e n e t i c e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t i nv i t r o[J]．B i o lR eＧp r o d,２０１２,８６(４):１２８．[１８]㊀L I NP,Y A N G YZ,L IX,e t a l．E n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s si s i n v o l v e d i n g r a n u l o s a c e l l a p o p t o s i sd u r i n g f o l l i c u l a r a t r e s i ai n g o a t o v a r i e s[J]．M o lR e p r o dD e v,２０１２,７９(６):４２３Ｇ３２．[１９]㊀B A R R E R A N,D O SS A N T O SN E T OPC,C U A D R OF,e t a l．I m p a c t o f d e l i p i d a t e d e s t r o u s s h e e p s e r u ms u p p l e m e n t a t i o no ni nv i t r o m a t u r a t i o n,c r y o t o l e r a n c ea n de n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s g e n e e x p r e s s i o no f s h e e p o o c y t e s[J]．P L o S O n e,２０１８,１３(６):e０１９８７４２．[２０]㊀Y A N G X,WU LL,C HU R ALR,e t a l．E x p o s u r e t o l i p i dＧr i c hf o l l i c u l a r f l u i d i s a s s o c i a t e dw i t he n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s sa n d i m p a i r e do o c y t em a t u r a t i o n i nc u m u l u sＧo o c y t e c o m p l e x e s[J]．F e r t i l S t e r i l,２０１２,９７(６):１４３８Ｇ４３．[２１]㊀F E R R E U X L,S A L L E M A,C H A R G U IA,e t a l．I s i t t i m e t o r e c o n s i d e rh o wt o m a n a g eo o c y t e sa f f e c t e db y s m o o t he n d oＧp l a s m i c r e t i c u l u ma g g r e g a t e s[J]．H u m R e p r o d,２０１９,３４(４):５９１Ｇ６００．[２２]㊀A L I I,L I U H X,Z HO N GＧS HU L,e t a l．R e d u c e d g l u t a t h i o n ea l l e v i a t e s t u n i c a m y c i nＧi n d u c e d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s i nm o u s e p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s[J]．JR e p r o d D e v,２０１８,６４(１):１５Ｇ２４．[２３]㊀D I C K SN,B O H R E RRC,G U T I E R R E ZK,e t a l．R e l i e f o f e nＧd o p l a s m i c re t i c u l u ms t r e s se n h a n c e sD N Ad a m a g e r e p a i r a n di m p r o v e s d e v e l o p m e n t o f p r eＧi m p l a n t a t i o ne m b r y o s[J]．P L o SO n e,２０１７,１２(１１):e０１８７７１７．[２４]㊀S O N GBS,K I MJS,Y O O NSB,e t a l．I n a c t i v a t e dS e n d a iＧv iＧr u sＧm e d i a t e d f u s i o n i m p r o v e s e a r l y d e v e l o p m e n t o f c l o n e db oＧv i n ee m b r y o sb y a v o i d i n g e n d o p l a s m i cＧr e t i c u l u mＧs t r e s sＧa s s oＧc i a t ed a p o p t o s i s[J]．Re p r o dF e r t i lD e v,２０１１,２３(６):８２６Ｇ３６．[２５]㊀L I N T,L E EJE,K A N GJ W,e t a l．T h e i nf l u e n c e a n dr o l eo f m e l a t o n i no n i nv i t r oo o c y t em a t u r a t i o na n d e m b r y o n i c d e v e lＧo p m e n t i n p i g a n d c a t t l e[J]．K o r e a n JA g r i c S c i,２０１７,４４:３０９Ｇ３１７．[２６]㊀L I N T,L E E J E,K A N GJW,e t a l．M e l a t o n i n s u p p l e m e n t a t i o nd u r i n gp r o l o n ge d i nv i t r om a t u r a t i o n i m p r o v e s t h e q u a l i t y a n dd e v e l o p m e n t o f p o o rＧq u a l i t yp o r c i n e o o c y t e s v i a a n t iＧo x i d a t i v ea n d a n t iＧa p o p t o t i c e f f e c t s[J]．M o lR e p r o dD e v,２０１８,８５(８Ｇ９):６６５Ｇ６８１．[２７]㊀MO C H I Z U K I M,M I Y A G I K,K I S H I G AM IS．O p t i m i z i n g t r e a t m e n t o f t a u r o u r s o d e o x y c h o l i c a c i d t o i m p r o v ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a f t e r i nv i t r om a t u r a t i o no f c u m u l u sＧf r e e o o c y t e s３１１贾甜甜等:内质网应激对哺乳动物卵母细胞成熟的影响研究进展i nm i c e[J]．P L o SO n e,２０１８,１３(８):e０２０２９６２．[２８]㊀P A R K H B,K I M MJ,J U N GBD,e t a l．E f f e c t o f e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m(E R)s t r e s s i n h i b i t o r t r e a t m e n t d u r i n gp a r t h e n o g eＧn e t i c a c t i v a t i o no nt h ea p o p t o s i sa n d i nv i t r od e v e l o p m e n to f p a r t h e n o g e n e t i c p o r c i n ee m b r y o s[J]．D e v R e p r o d,２０１８,２２(３):２３５Ｇ２４４．[２９]㊀P A R K Y R,P A R K H B,K I M MJ,e t a l．E f f e c t so f e n d o p l a sＧm i c r e t i c u l u ms t r e s s I n h i b i t o r t r e a t m e n t d u r i n g t h em i c r o m aＧn i p u l a t i o no f s o m a t i cc e l ln u c l e a r t r a n s f e r i n p o r c i n eo o c y t e s[J]．D e vR e p r o d,２０１９,２３(１):４３Ｇ５４．[３０]㊀Y A N G L,L E IL,Z H A O Q,e t a l．L y c i u m b a r b a r u m p o l y s a cＧc h a r ide i m p r o v e s t h ed e v e l o p m e n to fm o u s eo o c y t e sv i t r if i e da t t h e g e r m i n a l v e s i c l e s t a g e[J]．C r y ob i o l o g y,２０１８,８５:７Ｇ１１．[３１]㊀HU A N G N,Y U Y,Q I A OJ．D u a l r o l e f o r t h e u n f o l d e d p r o t e i n r e s p o n s e i nt h eo v a r y:A d a p t i o n a n d a p o p t o s i s[J]．P r o t e i nC e l l,２０１７,８(１):１４Ｇ２４．[３２]㊀L I N T,L E E J E,O Q A N I RK,e t a l．D e l a y e d b l a s t o c y s t f o r m aＧt i o no r a ne x t r ad a y c u l t u r e i n c r e a s e s a p o p t o s i s i n p i g b l a s t oＧc y s t s[J]．A n i m R e p r o dS c i,２０１７,１８５:１２８Ｇ１３９．P r o g r e s s o nR o l e s o fE n d o p l a s m i cR e t i c u l u mS t r e s s i nM a m m a l i a nO o c y t eM a t u r a t i o nJ I A T i a nＧt i a n,W E N Y a n g,G A O L e iＧl e i,WA N GL iＧl i,Y U A N Y iＧt i a n,L E IA nＧm i n(１．C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,S h a a n x i S t e mC e l lE n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i,７１２１００,C h i n a)A b s t r a c t:D u r i n g o o c y t em a t u r a t i o n a n db e f o r e e m b r y o i m p l a n t a t i o n,v a r i o u s t y p e s o f p r o t e i n sw i t h s p e c i f i c f u n c t i o n sm u s t b e f o l d e d a n dm o d i f i e d i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,w h i c h i s c r u c i a l f o rm a i n t a i n i n g o o c y t e m a t u r a t i o na n d e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t．H o w e v e r,t h es t i m u l a t i o no f e x t e r n a l a d v e r s e f a c t o r sw i l l d e s t r o y t h e f u n c t i o no fE R,h i n d e r p r o t e i n s y n t h e s i s,i n d u c e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s a n du n f o l d e d p r o t e i nr eＧs p o n s e,a n da p p r o p r i a t es t r e s s r e s p o n s e i sb e n e f i c i a l t oc e l l r e c o v e r y f u n c t i o n．O o c y t e sa n de a r l y e m b r y o s a r eh i g h l y s e n s i t i v e t o a l l k i n d s o f e x o g e n o u s s t i m u l i．M a n y s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s t r e s s a n dU P Rs i g n a l a f f e c t o o c y t em a t u r a t i o na n de m b r y o p r e i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n t．T h e p a p e r s u mＧm a r i z e d t h e s t a t u s o fE Rs t r e s s,U P Rs i g n a l i n gp a t h w a y a n d i t s r o l e i nm a mm a l i a no o c y t em a t u r a t i o na n d p r e i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n t,i no r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e f o ro o c y t em a t u r a t i o na n dh u m a nr e p r o d u c t i o n c l i n i c．K e y w o r d s:o o c y t e;e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s;u n f o l d e d p r o t e i n r e a c t i o n４１１动物医学进展㊀２０２０年㊀第４１卷㊀第４期(总第３２２期)。

犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【摘要】In this paper, the factors affecting the development of canine oocytes in vivo and in vitro maturation are reviewed, and its culture methods are summarized in order to provide a theoretical basis for overcoming the obstacles of canine related assisted reproductive technology and protecting precious and endangered species.%本文就犬卵母细胞体内发育及体外成熟的影响因素进行综述, 并对其培养方法进行了总结, 以期为克服犬相关辅助生殖技术的障碍, 保护珍贵和濒危犬种提供理论基础.【期刊名称】《特产研究》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】6页(P109-114)【关键词】犬;卵母细胞;体内发育;体外成熟【作者】曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【作者单位】中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;吉林农业大学,长春 130118【正文语种】中文【中图分类】Q954.42犬科动物多为季节性、单次发情动物，但经驯养的家犬，其季节性发情特点逐渐消失，全年均可出现发情，尤其春、秋季节的发情比例较高[1]。

ＴＢＰ相关凶ｒ３（ＴＲＦ３）在小鼠早期胚胎和细胞系中的表达及功能分析图１ＴＢＰ家族成员之间的进化关系㈣１．Ｚ．１ＴＲＦｌ第‘个ＴＢＰ相关因子ＴＲＦｌ首先在果蝇中发现，并且迄今为止也仅发现在果蝇中存在““。

ＴＲＦｌ的Ｃ末端与ＴＢＰＣ末端核心区域具有很高的同源性，可以与ＴＡＴＡ元件结合。

ＴＲＦｌ主要在胚胎、成体神经系统和雄性生殖细胞中表达。

ＴＲＦｌ也可以和ＴＦＩＩＡ和ＴＦＩＩＢ结合。

Ｈａｎｓｅｎ等（１９９７）“２１最初发现ＴＲＦｉ可能参与ＰｏｌＩＩ对部分组织特异性基因的转录，但同时他们也发现，多线染色体染色时，ＴＲＦＩ弓ＴＢＰ在染色体上具有不同的定位，ＴＦＲｌ集中在ＰｏｌＩＩＩ转录位点。

随后的生化分析表明，果蝇胚胎核抽提物中去除ＴＲＦｌ（而非ＴＢＰ）会导致ＰｏｌＩＩＩ的转录抑制”３，说明ＴＲＦｌ在ＰｏｌＩＩＩ的转录过程中起重要作用。

令人疑惑的是６图２不同物种ＴＲＦ３序列比较及与人ＴＢＰ序列比较…３黑色表示两个物种以上的ＴＲＦ３序列与ＴＢＰ保守，有变化的地方为灰色；蓝色表示３个物种以上的ＴＲＦ３序列保守。

ＴＢｐ序列中与ＴＡＴＡＴ元件（Ｉ）、ＴＦＩＩＡ（Ｖ）和ＴＦＩＩＢ（●）结合的位置分别在图中表示出。

２．早期胚胎的基因激活２．１卵母细胞和精子的成熟生长中的卵母细胞有一个很大的生发泡（有时也被称为生殖泡）（ｇｅｒｍｉｎａｌｙｅｓｉｅｌｅ，ＧＶ），相当于细胞的核，因此该阶段的卵母细胞也被称为ＧＶ期卵母细胞。

ＧＶ期卵母细胞存在活跃的转录，但随着卵母细胞的成熟，转录水平逐渐降低””。

充分生长的卵母细胞在激素的刺激下发生生发泡破裂（ＧＶｂｒｅａｋｄｏｗｎ），染色体浓缩，进行减数分裂，并最终停在第一次减数分裂的中期即ＭＩＩ期。

此时的染色体高度浓缩，转录沉默。

精子发生的最后一个阶段即拉长阶段，通过多步骤的蛋白交换过程，精子细胞核内的组蛋白最终被精子所特有的精蛋白代替。

成熟精子中ＤＮＡ与精蛋白并不形成核小体结构，而是形成晶体样结构，该结构比中期染色体的紧密程度还有高出６倍。