基因芯片技术的应用现状及展望
1基因芯片
1.1基本概念和原理
又称DNA 微阵列、DNA 芯片, 通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建成的微型生物化学分析系统,能够通过检测
基因的丰度来确定基因的表达模式和表达水平。由于常用硅芯片或玻片作为固相支持物, 并且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术, 所以称为基因芯片技术。基因芯片的工作原理与核酸分子杂交的方法是一致的, 都是运用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列进行杂交, 然后通过信号检测进行定性和定量分析。与传统的核酸杂交不同的是基因芯片是在一微小的片基如硅片、玻片和塑料片等表面上集成了大量的核酸分子识别探针, 能够在同一时间内平行分析大量的基因, 进行大量信息的筛选与检测, 实现对生物样品快速、并行、高效地进行检测或医学诊断。
1.2研究背景
80 年代初, 科学家提出了固相核酸杂交的设想, Bains 等首
先对固相杂交DNA 测序进行了有益的探索; 其后, 俄罗斯、美国及英国的科学家分别报道了用杂交测定核酸序列的方法。1991 年, Affymetrix 公司Fodor 等建立了原位光刻合成技术, 为寡核苷
酸在片原位合成制作高密度基因芯片奠定了基础, 标志着核酸检测技术已发展到了一个新的阶段。1994年, 俄美科学家共同研制了用于B- 地中海贫血基因突变筛查的基因芯片, 测序的速度提
高了近1 000 倍, 被认为是一种全新的快速测序方法。鉴于基因芯片潜在的巨大商业价值, 90年代中期开始, 国外更多的商业公司加入了芯片开发的行列。1996 年底, Affymetr ix 公司推出可应用的基因芯片和较完整的芯片制造、杂交、扫描及数据分析系统, 其它如GeneralScanning Inc、Telechem、Cartesian 等公司亦相继研制出芯片用激光共聚焦扫描仪及分析软件。到目前为止, 芯片技术在基础研究, 尤其是在基因表达方面已得到应用, 而在医学应用方面也已开发出少数基因诊断等相关芯片。但由于芯片和检测系统价格昂贵、专利及许多技术问题还有待解决, 因此目前尚未大规模的应用。在我国, 较早从事基因芯片研究的机构有清华大学、复旦大学、东南大学等。其中, 清华大学处于领先地位, 并得到国家重点支持。其它如东南大学在分子印章法制备高密度基因芯片、复旦大学在硅导电玻璃介质生物芯片制备、西安超群公司在三维立体基因芯片制造等方面也都取得了一定成果。
1.3基因芯片的分型
视分类方法不同可以分为以下几种主要类型：
a．无机片基和有机合成物片基的基因芯片
b．原位合成和预先合成然后点样的基因芯片
c．基因表达芯片和DNA测序芯片
另外根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列（或cDNA微阵列芯片）和寡核苷酸阵列（或芯片），根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片（Toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病
毒检测芯片）、P53基因检测芯片
1.4基因芯片核心技术
1.4.1载体表面化学修饰
基因芯片多以玻璃片为载体，由于玻璃片表面化学性质稳定，在连接上述各种活性基团之前，通常需要先进行硅烷化处理。玻
璃片的硅烷化使用硅烷化试剂，即硅烷耦合剂，是一种有机硅单体，具有两种以上不同反应基团，能起到把有机材料和无机材料
进行化学耦合的媒介作用。该类化合物一般具有RSiX3的化学结构，X表示水解基团，如甲氧基、乙氧基等，能与无机材料(玻璃、金属、二氧化硅)进行化学结合，R为有机官能团(如氨基、羟基、巯基等)，能与有机物质结合。在玻璃片处理过程中，比较常用的硅烷化试剂有氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、硫丙基
三甲氧基硅烷和N．氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷。硅烷化的玻璃片可以进行活性基团的连接，不同活性基团连接方法略有不同。修
饰后的载体应该达到表面均匀一致，容易进行共价的或非共价的
化学修饰，并且在荧光探针激光波长范围内有一个低的背景荧光。探针制备探针的制备主要有两种方法：一种方法是原位合成，即
直接在载体上原位合成探针，此种方法适合制作高密度寡核苷酸
芯片；另外一种方法是通过PCR进行扩增。模板的来源有两种：一是克隆化核酸片段，可以是序列信息保存在Gen—Bank等公共数据库中、商业出售的cDNA克隆、EST克隆，也可以是各个实验室从各种文库中筛选并保存下来的上述克隆；这些克隆化核酸片段经PCR
扩增后即用作探针。进行基因表达分析时，多数情况下采用此种cDNA探针。同一生物体中不同基因之间的同源性可能较高，PCR产物应代表其最可变的区域。另一种是基因组DNA，用特异性引物对其进行PCR扩增，得到需要的序列片段。
1.4.2靶序列荧光标记
基因芯片技术首选荧光染料作为标记，主要是因为荧光染料具有操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性等特点。荧光标记方法有直接标记和间接标记法。直接标记是利用反转录酶或PCR 反应将CyDye标记核苷酸直接渗入到样品中，这是最常用的一种标记方法。其局限性是酶对于CyDye标记核苷酸的低渗入效率，大多数酶不能均匀地渗入Cy3和Cy5荧光素，杂交信号不均一。Cy5的渗入效率通常不如Cy3高。间接标记又称合成后标记，是将一个化学活性核苷酸类似物(氨基烯丙基一dUTP)在链合成中掺入到PCR产
物或cDNA第一链中。氨基烯丙基-dUTP与无修饰的dUTP掺入效率相似，得到的探针随后用CyDye的活性反应物进行“合成后标记”，该活性反应物与氨基烯丙基一dUTP结合。这种标记方法的优点是能得到Cy3和Cy5更加均一的掺入和更强的信号。基因芯片打印基因芯片的打印方式有两种，即原位合成法和合成后交联法。原位光刻合成技术系Affyrmetrix公司的一项专利技术。运用这种方法制作的芯片探针密度可达106／cm2，即探针间隔为5～10Ⅱm。用这种方法制备的基因芯片需要预先设计、制造一系列掩膜，造价昂贵；制造过程中采用光脱保护法，掩膜孔径较小时会发生光衍
