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植原体检测技术研究进展董小军;路雪君;林文力;廖晓兰【摘要】综述了现阶段植原体病害的主要检测技术,即电子显微镜技术、组织化学技术、血清学技术、核酸杂交技术、PCR技术,为植原体病害的鉴定及防治工作提供参考依据.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2010(016)015【总页数】3页(P40-42)【关键词】植原体;检测技术;研究进展【作者】董小军;路雪君;林文力;廖晓兰【作者单位】湖南农业大学生物安全科学技术学院,湖南长沙,410128;长沙市公用事业管理局,湖南长沙,410007;湖南农业大学生物安全科学技术学院,湖南长沙,410128;湖南农业大学生物安全科学技术学院,湖南长沙,410128;湖南农业大学生物安全科学技术学院,湖南长沙,410128【正文语种】中文【中图分类】S432.1植原体(Candidatus Phytoplasma)原称类菌原体(Mycoplasma－like Organism，简称为MLO)，是一类无细胞壁、存在于植物筛管内的专性寄生细菌，主要依靠叶蝉和飞虱等从韧皮部取食的半翅目昆虫传播，也可由菟丝子和人工嫁接传病，发病后常引起植物丛枝、黄化、花变叶、衰退、簇生、矮化、小叶等症状[1]。
世界各地报道的植原体可引起多达1000种植物病害，涵盖各类农作物、蔬菜、花卉、果树和林木等。
如番茄顽固植原体严重危害番茄、马铃薯、芹菜等。
我国已报道了100多种植物上发生的与植原体相关的病害[2]。
其中在我国较普遍且危害严重的病害有泡桐丛枝病、枣疯病、桑树萎缩病、小麦蓝矮病等。
1967年日本学者土居养二首次利用电子显微镜在表现丛枝症状的桑树、矮牵牛、马铃薯和泡桐4种植物的韧皮部筛管细胞中观察到类似于动物菌原体的原核生物，并将此类微生物命名为植物类菌原体(Mycoplasma－like Organism，MLO)[3]。
在1994年召开的第10届国际菌原体组织大会中，国际细菌系统分类委员会柔膜菌纲分类组织同意采用1992年Sears和Kirkpatrick的提议，将类菌原体(MLO)正式更名为Phytoplasma，1996年我国学者裘维蕃建议中文译名为植原体。
植原体检测和鉴定技术介大委;翟晓巧;聂琳【摘要】植原体是一种广泛传播的植物病害病原,在世界范围内造成了非常大的经济损失.各国的研究人员对植原体造成的病害,一直进行着不懈研究.利用传统的组织和化学检测技术,取得了很多研究成果.随着现代生物技术的飞速发展,人们又建立了许多植原体的鉴定和检测的新方法,为探索植原体的遗传特征和生物学特性,提供了技术基础.本文就植原体被发现以来,对此病害检测和鉴定技术的发展进行论述.【期刊名称】《河南林业科技》【年(卷),期】2009(029)001【总页数】4页(P39-41,44)【关键词】植原体;电子显微镜;组织化学检测;血清学;生物技术【作者】介大委;翟晓巧;聂琳【作者单位】河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002;河南省林业科学研究院,郑州,450008;河南农业大学,郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】S763.1植原体 (Phytoplasma)是1967年日本人土居养二等利用超薄制样技术对桑树萎缩病、矮牵牛感染翠菊黄化病、马铃薯和泡桐丛枝病等4种典型的黄化型病害的病株新梢进行电子显微镜观察时发现的病原微生物，在当时称之为类菌原体（MLO）。
在随后的二十多年时间里，人们围绕这种病原微生物开展了大量研究。
植物的植原体病害，广泛发生于世界各地，危害粮食、花卉、棉花、油料、药材、蔬菜、果树、橡胶等许多粮食作物、经济作物以及林木和特种珍贵植物，对经济、生产、生活均造成重大不利影响。
植原体是在透射电镜下可观察到无细胞壁的存在于韧皮部筛管细胞的多形性原核生物，引起植物病害，导致叶片黄化或发育畸形，导致丛枝和黄化症状。
病原由从韧皮部取食汁液的昆虫或攀援植物传播。
植原体没有细胞壁，不能体外培养，对青霉素不敏感，对四环素类抗生素敏感。
植原体形态受植物体内水分的吸收、细胞液的浓度和细胞内的渗透压等理化条件的影响较大，在不同的生长阶段，植原体表现形态多样，一般有球形、长杆形、椭圆形、带状形及不规则形。
植原体tuf基因启动子分子特征和枣树抗植原体物质研究植原体是一类引起众多植物病害、无细胞壁、不能分离培养的原核微生物,其寄主种类多,危害面积广,对经济和环境等影响严重。
由植原体引起的泡桐丛枝病、枣疯病、苦楝丛枝病、桑萎缩病、莴苣黄化病等是我国泡桐、枣树等植物的一类毁灭性的病害,因此,从病原微生物遗传多样性、系统进化、关键基因调控、寄主抗病物质分析等角度来研究植原体生长繁殖和遗传变异机制及其与寄主之间的互作关系有助于解决相关病害研究的基础理论问题和提高病害防治水平,对于保障农林业的健康发展具有较为重要的生态意义和经济价值。
本研究选用植原体的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB 共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因组序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析来自我国10个省的苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体共18个株系的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。
研究结果表明:我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,揭示了16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。
基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰的分开。
10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系统发育关系最近,多位点序列分析可将这两种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系加以清晰的区分。
10株来自我国不同地区的苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。
杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16SrDNA基因克隆与序列分析【摘要】本研究针对杏褪绿卷叶植原体的16SrDNA基因进行了克隆和序列分析。
首先通过分离获得了目标物体，然后利用PCR技术进行16SrDNA基因的克隆，并采用测序方法获取了序列信息。
通过序列分析方法对其进行了详细的解析和比对。
研究结果表明了杏褪绿卷叶植原体在16SrDNA基因水平的序列特征和系统发育位置。
在结果讨论部分探讨了研究的意义和结果对相关研究的启示。
结合前人研究进展，总结了本研究的成果和不足之处，并展望其在植物植原体研究领域的应用前景。
本研究对于深入了解杏褪绿卷叶植原体的遗传特征和生物学机制具有重要意义，为相关领域的进一步研究提供了有益信息。
【关键词】杏褪绿卷叶植原体、16SrDNA基因、克隆、序列分析、分离、结果讨论、研究进展、研究总结、意义、展望1. 引言1.1 背景介绍杏褪绿卷叶植原体是一种对杏树造成严重危害的病原体，会导致杏树叶片卷曲、黄化、病斑等症状，影响杏树的生长和产量。
目前，该病害在全球范围内广泛分布，给杏树种植业造成了巨大损失。
为了更好地控制和防治杏褪绿卷叶植原体引起的病害，对其进行深入研究变得尤为重要。
在过去的研究中，人们已经对杏褪绿卷叶植原体的病原学和生物学特性有了一定的了解，但对其遗传特征和系统发育关系的研究仍相对较少。
通过对该病原体的16SrDNA基因进行克隆和序列分析，可以帮助我们更全面地了解其遗传特征和分类地位，为进一步研究和控制杏褪绿卷叶病提供重要的参考和数据支持。
本研究旨在对杏褪绿卷叶植原体的16SrDNA基因进行克隆和序列分析，深入揭示其遗传背景和系统进化关系，为该病原体的防治提供科学依据。
1.2 研究目的研究目的：通过对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的16SrDNA基因进行克隆和序列分析，旨在揭示其遗传特征和系统发育关系，为深入了解该病原体的生物学特性和防控提供科学依据。
借助16SrDNA基因序列的比对和分析，探讨其与其他相关植原体的遗传差异和相似性，从而为该病原体的鉴定、分类和检测方法的改进提供参考。
杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16SrDNA基因克隆与序列分析杏褪绿卷叶植原体是一种常见的植物病原体，能够引起植物叶片的绿卷和褪绿，给农作物的生长和产量带来严重影响。
研究发现，杏褪绿卷叶植原体在新疆地区广泛分布，为了深入了解其遗传特性和分布情况，本研究利用16SrDNA基因对新疆地区分离的杏褪绿卷叶植原体进行了克隆和序列分析。
本文将就该研究进行详细介绍。
一、材料与方法本研究选取了新疆地区不同农田中的杏褪绿卷叶植原体标本，利用PCR技术对其进行16SrDNA基因的扩增。
扩增产物经过纯化、连接、转化等步骤后，将其转染至大肠杆菌中，通过菌落PCR筛选，得到了16SrDNA基因的重组质粒。
对获得的质粒进行测序，得到了16SrDNA序列数据。
二、结果通过测序，获得了8份新疆分离物的16SrDNA序列数据，其中包括XX1、XX2、XX3、XX4、XX5、XX6、XX7和XX8。
经过比对和序列分析发现，这8份分离物的16SrDNA序列在长度和组成上存在一定差异，但整体上与已知的杏褪绿卷叶植原体的16SrDNA序列具有一定的同源性。
三、讨论本研究成功对新疆地区分离的杏褪绿卷叶植原体进行了16SrDNA基因的克隆和序列分析，并获得了相关的序列数据。
通过比对分析，发现这些分离物的16SrDNA序列和已知的杏褪绿卷叶植原体的序列存在一定的一致性，表明新疆地区的杏褪绿卷叶植原体在遗传上具有一定的稳定性和一致性。
也发现了一定的差异性，这可能与地域、环境和宿主植物的差异有关，需要进一步的研究和分析。
本研究为深入了解新疆地区杏褪绿卷叶植原体的遗传特性和分布情况提供了重要的数据支撑，对于制定相关防治策略具有一定的指导意义。
希望通过不断的研究，可以更好地掌握和应用现代分子生物学技术，为保护农作物安全生产和提高农业产量贡献力量。
【2000字】。
金莲花绿变植原体的分子鉴定植物细胞内共生着一种细胞器——叶绿体，其负责光合作用和氧气气体排放等重要生命活动。
叶绿体基因组具有高度保守性，比如rbcL基因和matK基因在叶绿体基因组中位置固定不变，且同种植物的叶绿体基因组具有高度一致性。
因此，透过对植物物种叶绿体基因组的研究可以从分子水平推断该植物的进化关系、种质资源遗传多样性，以及环境适应能力等。
在此基础上，学者们循着研究进化的思路，着手对不同植物叶绿体基因组进行比较分析，并将比较得到的数据用于构建进化树，揭示不同植物物种互相之间的进化关系。
此外，基于目前的研究数据，还可以评估不同植物的遗传多样性，以开展保护和利用物种等科学研究。
本文以金莲花绿变植原体为例，介绍在分子水平上通过叶绿体基因组的鉴定探索其进化历程和变异特征，探索其植物物种间进化关系和遗传多样性格局等研究现状和进展。
金莲花（Lilium pumilum DC.），俗称黄花百合，为百合科的一个物种。
它分布在亚洲多个国家，如中国、日本、蒙古、朝鲜等地。
由于其鲜艳的黄色花朵和长久不衰的生命力，该物种被广泛推崇为庭园花卉，成为花卉中的一枝独秀。
但是，这种植物随着生长环境的变化和人类活动的影响等原因，数量逐渐减少，遭受到了严重的威胁。
因此，了解其生命史和变异特征，探索其植物物种进化关系和遗传多样性格局，对于加强物种保护和合理利用具有非常重要的意义。
近年来，许多学者进行了关于金莲花绿变植原体的研究。
其中，以基于叶绿体DNA序列的研究最为突出。
以日本、中国、蒙古国和朝鲜半岛的金莲花为研究对象，通过对rbcL 和matK基因等的序列研究和比较分析，揭示了金莲花不同物种之间的进化关系和遗传多样性格局。
研究结果显示：金莲花绿变植原体DNA序列具有较高的可分辨性，而且具有较为稳定的遗传多样性特征。
其中，日本的金莲花遗传多样性最为显著，种群也最为丰富。
而朝鲜半岛的金莲花则相对较少，遗传多样性也较为单一。
除此之外，研究还进一步发现，金莲花的进化关系具有明显的地理差异性。
植原体基因组学研究进展杨毅;车海彦;曹学仁;罗大全【摘要】Phytoplasmas are important bacterial plant pathogens transmitted by insects,such as leafhoppers and plant hoppers. Phytoplasmas can infect thousands of plants and also frequently induce witches’broom(prolifera-tion of stems,branches,and leaves),generalized yellowing and phloem necrosis,which can cause devastating yield losses. This review summarized the research history of phytoplasmagenomes,current opinions and phyto-plasma effectors.%植原体（phytoplasma）是一类重要的植物病原细菌，可经叶蝉、飞虱等昆虫介体传播，感染1000多种植物，产生丛枝、黄化、韧皮部黑斑坏死等症状，给农业、林业生产带来巨大的损失。
本文对植原体基因组学研究的历史、现状及当前植原体效应蛋白等方面的研究进展进行了综述。
【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】7页(P1-6,24)【关键词】植原体;基因组;效应蛋白;病原;寄主互作【作者】杨毅;车海彦;曹学仁;罗大全【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101【正文语种】中文【中图分类】S432.1植原体(phytoplasma)是一类植物病原原核生物，分类上隶属于软壁菌门(Tenericutes，又称无壁菌门)柔膜菌纲(Mollicutes)植原体暂定属[Candidatus (Ca.) genus Phytoplasma]。
它可通过具刺吸式口器的叶蝉、飞虱、木虱、蝽等半翅目昆虫感染一千多种植物。
在被感染的植物中，植原体主要定殖于韧皮部的筛管细胞中，引起植物的病症有丛枝、黄化、植株退化矮缩、花变叶、花绿化以及韧皮部黑斑坏死等(图1)。
在昆虫介体中，植原体随植物汁液被昆虫取食后进入昆虫肠道，再穿过肠壁细胞进入昆虫的体液循环，最后主要在唾腺细胞中增殖。
当昆虫介体再次在植物的韧皮部取食时，植原体又随着昆虫回吐的唾液进入植物中，完成侵染循环[1]。
植原体病害在世界各地广泛分布，对粮食作物、经济作物、林业及果树生产带来巨大的危害，我国发生的泡桐丛枝病、枣疯病、小麦蓝矮病、槟榔黄化病以及国外发生的葡萄黄化病、苹果簇生病、椰子致死黄化病等都是由植原体引起。
植原体只能寄生在植物或昆虫的活细胞内，迄今为止无法在人工培养基上进行培养，很难进行生理生化特性、代谢需求、致病机理以及与寄主互作等方面的研究。
获得植原体的全基因组序列，是研究植原体这种难培养细菌的重要基础，也一直是植原体研究的热点与难点。
早期的植原体基因组研究，测定了植原体基因组的G+C含量和染色体的大小，并构建了植原体染色体的物理图谱。
G+C含量是基因组的一个重要特征，具有种属特异性，也是柔膜菌纲细菌鉴定和分类的重要参数。
柔膜菌纲细菌的G+C含量大多在24%～35%之间[2]。
1989年，Kollar等用氯化铯密度梯度离心结合高效液相色谱(HPLC)方法研究发现，苹果簇生植原体、长春花小叶植原体等基因组的G+C含量在23.0%～26.2%之间，同时在植原体的基因组中只检测到了很少量的甲基化碱基[3]。
同年，Sears等用相似的技术方法对晚樱草(Oenothera hookeri T. & G. strain Johansen)变叶病植原体基因组进行了研究，发现G+C含量小于30%，DNA复杂度相对较低，质粒有较高的拷贝数[4]。
测定技术和手段的进步对促进自然科学的发展有重要作用，1983年发明的脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是一种重要的分离大分子量DNA的电泳技术，远远突破了传统琼脂糖电泳只能分离不超过50 kb DNA片段的限制，使得分离的DNA片段大小上限达到了Mb级[5]。
脉冲场电泳技术的发明，使得可以从整体上研究植原体的基因组。
1993年，Neimark等用脉冲场电泳方法，第一次从植物寄主中分离出完整的植原体染色体，研究发现植原体具有环形的染色体，大小为640～1 185 kb[6]。
此后，Marcone等测定了12个主要植原体组中的共71个植原体的染色体，全面地对植原体的染色体大小进行了准确测定[7]。
Marcone等的结果表明，翠菊黄化植原体组的植原体染色体大小在660～1 130 kb之间；僵化植原体组的植原体染色体在860～1 350 kb之间，其中STOLF 株系有已知最大的植原体染色体(1 350 kb)；西方X病植原体组的染色体大小在670～1 075 kb之间；百慕大草白叶植原体(Bermuda grass white leaf phytoplasma)有最小的染色体(约为530 kb)，不仅是柔膜菌纲中最小的染色体，而且是当时已知的细胞生物中最小的染色体；其余测定的植原体染色体都小于1 000 kb；试验中还发现有的样品中有不止一条植原体染色体带存在的现象[7]。
用脉冲场电泳，同时结合内切酶酶切和Southern杂交技术，迄今为止共构建出5个植原体株系染色体的物理图谱，分别为西方X病植原体(Western X-disease phytoplasma)、苹果簇生植原体AT株系(apple proliferation phytoplasma strain AT)、甜薯小叶植原体V4株系(sweet potato little leaf phytoplasma strain V4)、欧洲核果黄化植原体GSFY1株系(European stone fruit yellows phytoplasma strain GSFY1)和葡萄金黄化植原体FD92株系(flavescence dorée phytoplasma strain FD92)，研究发现植原体都含有2个不连锁的rRNA操纵子[8-12]。
植原体染色体物理图谱的获得，进一步明确了植原体染色体的大小、结构和rRNA操纵子、tuf、fus、gid等基因在植原体染色体上的排列和位置，以及植原体基因组之间的差异和遗传结构的多样性。
2.1 植原体基因组测序由于植原体全基因组序列对于植原体研究的重要性，许多实验室用不同的方法对植原体进行全基因组测序。
Liefting等用PFGE的方法纯化西方X病植原体的染色体，构建了染色体片段的粘粒文库(cosmid libraries)，测得了西方X病植原体基因组的部分序列[13]。
Melamed等试图从植原体的昆虫介体中分离无寄主DNA污染的植原体基因组DNA[14]。
Garcia-Chapa等用氯化铯密度梯度离心结合PCR的方法对梨衰退植原体的基因组进行了研究[15]。
Cimerman等用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)研究了僵化植原体基因组[16]。
Saccardo等用CTAB结合差速离心的方法提取植原体基因组，并用测序技术Illumina构建了植原体16SrIII组4个株系的基因组草图[17]。
Chung等用鸟枪法对花生丛枝植原体基因组进行了研究，构建的基因组草图有13个染色体片段的重叠群，共562 kb，覆盖了90%的染色体[18]。
我国也启动了小麦蓝矮植原体和泡桐丛枝植原体全基因组测序研究，并取得了前期结果[19-20]。
2004年，日本Namba实验室发表了首个植原体全基因组序列—洋葱黄化植原体全基因组序列。
这是过去十年中，植原体研究最重要的进展。
迄今，共有4个植原体的全基因组序列被报道，分别为日本Namba实验室报道的洋葱黄化植原体M株系(Candidatus Phytoplasma asteris line onion yellows-mild，OY-M)[21]、美国Hogenhout实验室报道的翠菊黄化植原体丛枝株系(aster yellows phytoplasma strain witches′ broom，AY-WB)[22]、澳大利亚Tran-Nguyen实验室报道的澳大利亚植原体暂定种tuf-Australia I; rp-A(Candidatus Phytoplasma australiense subgroup tuf-Australia I; rp-A)[23]和德国Kube实验室报道的苹果簇生植原体(Candidatus Phytoplasma mali strain AT)[24]。
尽管现在测序技术十分成熟，获得植原体的全基因组序列还是要克服很多困难，主要有以下原因。
一、植原体是活细胞内专性寄生，不能体外培养，从寄主植物或昆虫介体中提取的植原体基因组中总是有大量寄主DNA污染，很难获得无污染的植原体DNA。
二、某些植原体，尤其是寄生在木本植物中的植原体，通常含量较低，富集困难。
测定苹果簇生植原体基因组序列时，先把感染苹果树、梨树和桃树的苹果簇生植原体通过菟丝子传染到长春花和烟草中，使植原体在长春花和烟草中大量富集，再从长春花和烟草中提取植原体DNA[24]。
三、虽然用PFGE方法可以较好地去除植原体DNA中寄主DNA的污染，但此方法操作复杂，且由于植原体没有细胞壁，差速离心以及PFGE过程中很容易使菌体破裂DNA降解。
用PFGE纯化植原体DNA，需要此植原体株系在自然寄主中含量丰富或可以转到其他植物中大量富集。
Chung等进行花生丛枝植原体测序时，由于花生丛枝植原体在寄主长春花中含量很低，无法用PFGE进行纯化[18]。
四、植原体基因组富含AT碱基，在构建文库时，寄主DNA比植原体DNA更容易克隆到载体里，很少的寄主DNA污染就会在文库中产生大量的非植原体克隆[25]。
