蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考

中国畜牧兽医 2022,49(8):3131-3139C h i n aA n i m a lH u s b a nd r y &Ve t e r i n a r y Me d i c i n e 牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备王 炜,韩慧慧,丁乃峥,何成强(山东师范大学生命科学学院,山东省动物抗性重点实验室,济南250014)摘 要:ʌ目的ɔ应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(B V D V )E 0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E 0蛋白多克隆抗体用于B V D V 的检测技术研究㊂ʌ方法ɔ采用P C R 扩增B V D V 的E 0基因,将其连接至p E T -28a (+)构建重组表达载体p E T 28a -E 0㊂将重组质粒转化大肠杆菌B L 21感受态细胞,经I P T G 诱导㊁亲和层析纯化后,通过S D S -P A G E 和W e s t e r nb l o t t i n g 鉴定E 0蛋白的表达情况㊂将纯化的E 0蛋白免疫小鼠制备B V D VE 0多克隆抗体,并通过W e s t e r nb l o t t i n g ㊁细胞免疫荧光试验㊁E L I S A 等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在B V D V 检测中的应用㊂ʌ结果ɔ成功构建原核表达载体p E T 28a -E 0,表达并纯化E 0蛋白,制备的B V D V E 0多克隆抗体可特异性识别纯化的E 0蛋白及p E T 28a -E 0在B L 21中表达的总蛋白㊂进一步W e s t e r nb l o t t i n g ㊁细胞免疫荧光试验㊁双抗夹心法E L I S A 证明制备的E 0多克隆抗体可用于B V D V 的检测㊂间接E L I S A 结果表明,E 0多克隆抗体效价高于1ʒ64000㊂ʌ结论ɔ制备的B V D V E 0多克隆抗体效价高㊁抗原结合特异性强,为B V D V E 0蛋白的生物学功能研究及B V D V 的检测提供了材料支持㊂关键词:牛病毒性腹泻病毒(B V D V );E 0基因;原核表达;多克隆抗体中图分类号:S 852.65+3文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.08.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-01-29基金项目:山东省重点研发项目(2017G N C 10125㊁2019G S F 107020)联系方式:王炜,E -m a i l :471654737@q q .c o m ㊂通信作者何成强,E -m a i l :h c q i a n g@s d n u .e d u .c n P r o k a r y o t i cE x pr e s s i o no fB o v i n eV i r a l D i a r r h e aV i r u sE 0P r o t e i n a n dP r e p a r a t i o no f P o l y c l o n a l A n t i b o d yWA N G W e i ,H A N H u i h u i ,D I N G N a i z h e n g ,H EC h e n g q i a n g(S h a n d o n g K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lR e s i s t a n c e ,C o l l e g e o f L i feS c i e n c e s ,S h a n d o n g N o r m a lU n i v e r s i t y ,J i n a n 250014,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h eE 0p r o t e i no fB o v i n ev i r a l d i a r r h e av i r u s (B V D V )w a se x p r e s s e db yE .c o l i ,a f t e r p u r i f i c a t i o n ,t h eE 0p r o t e i n p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e db y i m m u n i z i n g mi c e ,w h i c hw a s t h e nu s e d f o rB V D Vd e t e c t i o n .ʌM e t h o d ɔT h eB V D V E 0g e n ew a s a m p l i f i e db y PC R a n dl i g a t e di n t o p E T -28a (+)t o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n te x pr e s s i o n v e c t o r p E T 28a -E 0.T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d w a st r a n s f o r m e di n t o E .c o l i B L 21c o m pe t e n tc e l l s .Af t e rI P T Gi n d u c t i o n a n da f f i n i t y c h r o m a t og r a ph yp u ri f i c a t i o n ,t h ee x p r e s s i o no fE 0p r o t e i n w a si d e n t i f i e db y S D S -P A G Ea n d W e s t e r nb l o t t i n g .T h e p u r i f i e dE 0p r o t e i nw a s i m m u n i z e d i n t om i c e t o p r e pa r eB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t ib o d i e s ,a n d t h e s p ec i f i c i t y a nd t i te r of t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e sw e r e d e t e c t e d b y W e s t e r nb l o t t i ng ,c e l l i m m u n o f l u o r e s c e n c e ,E L I S Aa n do th e r t e s t s ,a sw e l l a s t h ea p pl i c a t i o ni n B V D Vv i r u sd e t e c t i o n .ʌR e s u l t ɔT h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p E T 28a -E 0w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t ed ,a n dt h eE 0p r o te i n w a se x p r e s s e da n d p u r if i e d .T h e p r e p a r e dB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y c o u l ds p e c i f i c a l l y r e c og n i z eth e p u ri f i e dE 0p r o t e i na n dt h et o t a l p r o t e i ne x p r e s s e db y中国畜牧兽医49卷p E T28a-E0i nB L21.F u r t h e r,W e s t e r nb l o t t i n g,c e l l u l a r i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n dd o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c hE L I S A p r o v e d t h a t t h e p r e p a r e dE0p o l y c l o n a l a n t i b o d y c o u l db e u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o fB V D V.T h er e s u l t so f i n d i r e c tE L I S A s h o w e dt h a tt h et i t e ro fE0p o l y c l o n a la n t i b o d y w a s h i g h e r t h a n1ʒ64000.ʌC o n c l u s i o nɔT h e p r e p a r e dB V D VE0p o l y c l o n a l a n t i b o d y h a d a h i g h t i t e r a n d s t r o n g a n t i g e n-b i n d i n g s p e c i f i c i t y,w h i c h p r o v i d e d m a t e r i a l s u p p o r t f o r t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n a l s t u d y o f B V D V E0p r o t e i na n d t h e d e t e c t i o no f B V D V.K e y w o r d s:B o v i n ev i r a ld i a r r h e av i r u s(B V D V);E0g e n e;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s牛病毒性腹泻病毒(B o v i n e v i r a ld i a r r h e a v i r u s,B V D V)作为牛病毒性腹泻(b o v i n e v i r a l d i a r r h e a,B V D)的病原体,可引起牛腹泻㊁胃肠道炎症㊁呼吸系统疾病㊁生殖障碍等一系列临床症状[1],对畜牧养殖业造成严重的经济损失[2]㊂在中国, B V D作为一种瘟疫性传染病,被列为三类动物疫病中的牛病之一[3]㊂B V D V可以感染野生及家养动物[4],尤其是被感染的妊娠母牛产下的持续性感染(p e r s i s t e n t i n f e c t i o n,P I)小牛,能不断从鼻眼部分泌物及排泄物中排出具有传染性的B V D V,这种持续性病毒来源,成为驱动B V D V流行的关键因素,使得B V D V的清除具有较高难度[5-6]㊂B V D V属于黄病毒科中的瘟病毒属[7],长度约12.3k b,是正义R N A病毒,主要分B V D V-1和B V D V-2[8-9]㊂B V D V具有较高的流行率,牛群中抗体阳性率较高[10-11]㊂B V D V感染后,糖蛋白E2作为B V D V感染后免疫反应的主要目标之一,被广泛应用于B V D V疫苗的研制[12-13]㊂但E2蛋白的突变率高,往往导致免疫的失败[14-15]㊂B V D V的包膜蛋白E0(E r n s)由约228个氨基酸组成,大小约26k u,具有R N A酶活性,可降解B V D V R N A[16],是瘟病毒编码蛋白中保守性相对较高㊁参与病毒摄取细胞及感染性病毒粒子有效组装的重要结构蛋白[17],较E2抗原多样性少,也是宿主抗体应答的主要靶标之一[18-19]㊂E0作为B V D V免疫原性蛋白具有很高的抗原保守性[20],对于阻断宿主对病毒感染的反应较为重要[21],通过阻断干扰素(I F N)的合成来颉颃宿主的先天免疫防御,从而建立长期感染[22]㊂针对B V D V E0的抗体能有效结合细胞及其培养物中的B V D V㊂目前,E0蛋白因其独特的免疫学特点逐渐成为抗原蛋白免疫法制备相应抗体的候选抗原㊂本研究通过P C R扩增E0基因,构建p E T28a-E0原核表达载体,通过大肠杆菌表达系统诱导表达E0蛋白,采用亲和层析纯化E0蛋白,将其免疫小鼠收集血清制备B V D V E0多克隆抗体㊂然后通过W e s t e r nb l o t t i n g㊁细胞免疫荧光试验㊁E L I S A等试验检测多克隆抗体的特异性,为B V D V E0蛋白的结构和功能研究及B V D V的检测提供了理论依据㊂1材料与方法1.1材料B V D V S i n g e r_A r g株(G e n B a n k登录号: D Q088995.2)㊁大肠杆菌D H5α感受态细胞㊁大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞㊁乳仓鼠肾细胞系B H K-21㊁牛肾细胞系M D B K㊁B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V和p E T-28a(+)均由山东师范大学生命科学学院动物生殖发育与疾病实验室保存;6~8周龄IC R小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司㊂1.2主要试剂D ME M㊁P B S㊁F B S(V i v a C e l l)均购自上海逍鹏生物科技有限公司;限制性内切酶㊁T4D N A L i g a s e (2011A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;A p e x H F H S D N A P o l y m e r a s e F S M a s t e r M i x (A D12202)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司; P A G E凝胶快速制备试剂盒12.5%(P G113)购自上海雅酶生物医药科技有限公司;H i s标签鼠单克隆抗体(A B0002)㊁b e t a-A c t i nA n t i b o d y(A B0035)㊁辣根过氧化物酶(H R P)标记的羊抗鼠I g G (A B0102)㊁H R P标记的羊抗兔I g G(A B0101)和A l e x a荧光488标记的羊抗鼠I g G(A B0142)均购自泊湾生物科技有限公司;弗氏佐剂(F5881/F5506)购自上海懋康生物科技有限公司;N iN T A b e a d s (S A004100)购自常州天地人和生物科技有限公司;全自动倒置荧光显微成像系统(型号D M i8)购自徕卡仪器有限公司;酶标仪(型号S p e c t r a M a x M5)购自M o l e c u l a rD e v i c e s美谷分子仪器(上海)有限公司㊂1.3方法1.3.1引物设计与合成根据B V D V S i n g e r_A r g株(G e nB a n k登录号:D Q088995.2)的E0基因序列,利用D N AMA N软件设计E0基因的上㊁下游23138期王炜等:牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备引物:B V D V-E0-F:5'-C G G A A T T C A T A A C A C A G T G G A A C C T A C A A G A C-3'(下划线处为E c o RⅠ识别位点);B V D V-E0-R:5'-A A T C T C G A G C T A G G G G G A A G C C G C G T A T-3'(下划线处为X h oⅠ识别位点),预期扩增片段大小为684b p㊂引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成㊂1.3.2原核表达载体p E T28a-E0的构建以实验室保存的p M C18-B V D V质粒为模板,P C R扩增E0基因片段㊂P C R反应体系25μL:A p e x H F H S D N AP o l y m e r a s eF S M a s t e r M i x12.5μL,上㊁下游引物各1μL,模板1μL,灭菌d d H2O9.5μL㊂P C R 反应程序:98ħ预变性5m i n;98ħ变性30s,65ħ退火30s,72ħ延伸45s,共30个循环;72ħ延伸8m i n;4ħ保存㊂P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的产物并纯化,将E0片段和p E T-28a(+)载体经E c o RⅠ和X h oⅠ37ħ水浴酶切2.5h,然后使用T4D N A L i g a s e16ħ连接过夜,将连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,经菌落P C R筛选阳性克隆,提取重组质粒经E c o RⅠ和X h oⅠ双酶切鉴定后,由青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序㊂1.3.3原核表达载体p E T28a-E0的诱导表达将测序成功的p E T28a-E0和p E T-28a(+)转化大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞,培养菌液D600n m为0.6~0.8时,添加1m m o l/L的I P T G在37ħ条件下诱导4h,收集菌体进行12.5%的S D S-P A G E,经考马斯亮蓝染色,脱色液脱色后观察E0蛋白的表达情况㊂因重组质粒带有H i s标签,以H i s标签鼠单克隆抗体为一抗,W e s t e r nb l o t t i n g检测诱导蛋白㊂1.3.4可溶性分析取诱导表达E0蛋白的p E T28a-E0菌体,8000r/m i n离心10m i n收集菌体沉淀,加入P B S重悬菌体沉淀,冰水浴条件下超声破碎菌体:30m i n,功率400W,开4s,关6s, 8000r/m i n离心2m i n取上清和沉淀,通过12.5%的S D S-P A G E分析E0蛋白的可溶性㊂1.3.5 E0蛋白的纯化及鉴定依据步骤1.3.3和1.3.4大量诱导p E T28a-E0重组菌体,超声破碎后离心收集沉淀,采用N iN T A b e a d s亲和层析纯化蛋白,经上柱结合㊁洗涤缓冲液洗涤杂蛋白㊁洗脱缓冲液洗脱目的蛋白等步骤纯化E0蛋白,将纯化后的E0蛋白处理后通过12.5%的S D S-P A G E分析蛋白纯化情况㊂以H i s标签鼠单克隆抗体(1ʒ2000)为一抗,1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白纯化结果㊂1.3.6免疫小鼠将纯化的E0蛋白使用B C A 蛋白浓度测定试剂盒测定浓度后与弗氏佐剂等体积混合超声乳化成油乳状,背部皮下多点注射免疫4只6~8周龄I C R小鼠(50~100μg/只)㊂免疫前鼠尾采血收集血清备用,每次免疫间隔2周进行㊂第1次使用弗氏完全佐剂,第2㊁3次免疫使用弗氏不完全佐剂,3次免疫后均采血收集血清备用㊂1.3.7 B V D V E0多克隆抗体特异性检测将纯化的E0蛋白与蛋白上样缓冲液按4ʒ1的比例混合后沸水煮8m i n,将其作为抗原通过W e s t e r n b l o t t i n g检测B V D VE0多克隆抗体与E0蛋白的特异性结合㊂蛋白样先经12.5%的S D S-P A G E分离,然后转移至P V D F膜,将P V D F膜用封闭液封闭2h,将4只小鼠的B V D V-E0多克隆抗体和免疫前血清以1ʒ1000比例稀释分别作为一抗,4ħ孵育过夜,T B S T清洗后以1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,室温孵育2h,T B S T清洗后显色并拍照㊂将p E T28a-E0质粒转化大肠杆菌B L21感受态细胞,收集菌体细胞裂解提取蛋白,如上述处理后作为抗原,将B V D V-E0多克隆抗体和免疫前血清1ʒ1000稀释作为一抗,通过W e s t e r nb l o t t i n g检测B V D V E0多克隆抗体的特异性㊂1.3.8 B V D V检测将B H K-21细胞铺于6孔细胞培养板,待细胞长至75%时,将B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V转染至B H K-21细胞,48h后收集包装的病毒上清并感染M D B K细胞,培养48h后,收集细胞裂解提取蛋白,以制备的B V D V E0多克隆抗体(1ʒ1000)为一抗,1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠为二抗,W e s t e r n b l o t t i n g检测B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V在B H K-21细胞内的表达和包装病毒在M D B K细胞内的复制,其中试验组和B H K-21/M D B K空白细胞阴性对照组分别做2个重复㊂通过细胞免疫荧光检测多克隆抗体的应用效果,将M D B K细胞爬片并培养至贴壁状态㊁将B V D V病毒液接种细胞,感染培养24h,P B S清洗3次后用4%的多聚甲醛固定8m i n,P B S清洗3次,透膜液37ħ透膜30m i n,P B S清洗3次后用5%的B S A室温封闭1h,然后将B V D V E0多克隆抗体稀释400倍作为一抗,37ħ孵育1h,P B S再次清洗后以1ʒ200稀释的A l e x a荧光488标记的羊抗鼠I g G为二抗,37ħ孵育1h,P B S清洗3次,D A P I染核液染核5m i n,最后P B S清洗3次后封片,然后镜检并拍照㊂通过双抗夹心法E L I S A检测B V D V,将免疫前3313中国畜牧兽医49卷小鼠血清和B V D V E0多克隆抗体倍比稀释后4ħ过夜包被酶标板,P B S T清洗3次后用10%的马血清37ħ封闭2h,P B S T清洗3次,然后滴加病毒感染复数(MO I)为0.1~0.5的B V D V病毒液,37ħ孵育2h,再次P B S T清洗3次后加入H R P标记的羊抗鼠I g G(1ʒ5000),37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后每孔加入100μL的T M B显色液,室温避光显色10m i n,最后每孔加入100μL终止液终止反应,用酶标仪测定D450n m值并分析结果,以阳性血清D450n m值/阴性血清D450n m值(P/N值)>2的抗体稀释度定义为抗血清效价㊂1.3.9 B V D V E0多克隆抗体效价测定通过E L I S A法检测4只小鼠的抗血清效价,将纯化的E0蛋白稀释至4μg/m L后包被酶标板,用10%的马血清37ħ封闭2h,T B S T清洗3次后以4只小鼠免疫前血清(阴性对照)和B V D V E0多克隆抗体分别倍比稀释为一抗,37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后,以1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后每孔加入100μL的T M B显色液,室温避光显色10m i n,终止反应后用酶标仪测定D450n m值并进行结果分析㊂2结果2.1p E T28a-E0载体的构建使用E c o RⅠ和X h oⅠ对p E T28a-E0重组质粒进行双酶切鉴定(图1),在5369和684b p处出现与预期相符的载体条带和目的条带,经测序比对分析,原核表达载体p E T28a-E0构建成功㊂M,D L10000D N A M a r k e r;1,空载质粒双酶切;2,p E T28a-E0重组质粒;3,p E T28a-E0重组质粒双酶切M,D L10000D N A M a r k e r;1,D o u b l e d i g e s t i o n o fe m p t y v e c t o r p l a s m i d;2,R e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T28a-E0; 3,D o u b l e d i g e s t i o no f r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T28a-E0图1重组质粒的双酶切鉴定F i g.1D o u b l e d i g e s t i o n i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d 2.2E0蛋白的表达㊁可溶性分析㊁纯化及鉴定通过12.5%的S D S-P A G E观察发现,经1m m o l/L的I P T G在37ħ条件下诱导的p E T28a-E0重组质粒在26k u处出现B V D V E0目的条带,而p E T-28a(+)空载质粒和未诱导的重组质粒处未出现(图2A)㊂可溶性分析发现,E0蛋白主要存在于沉淀中,即其在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在(图2A)㊂取诱导表达E0蛋白的p E T28a-E0菌体,超声破碎离心后通过N iN T Ab r e a d s亲和层析纯化目的蛋白,经12.5%的S D S-P A G E分析发现纯化出杂蛋白较少㊁浓度较高的E0蛋白(图2A)㊂以H i s标签鼠单克隆抗体为一抗,H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,经W e s t e r nb l o t t i n g检测,诱导蛋白(图2B)和纯化蛋白(图2C)在26k u处均出现目的条带,表明B V D V E0蛋白已成功诱导纯化,且纯化蛋白特异性良好,可用于后期免疫试验㊂2.3B V D VE0多克隆抗体特异性检测如图3所示,E0纯化蛋白免疫前采集的4只小鼠血清(免疫前血清)均未能检测出目的条带(图3A),而E0纯化蛋白免疫后采集的小鼠血清(B V D V E0多克隆抗体)则能特异性检测出纯化后的E0蛋白(图3B);免疫前血清在p E T-28a(+)和p E T28a-E0均未检测出目的条带(图3C)㊂B V D V E0多克隆抗体在p E T28a-E0检测出目的条带(图3D),而在p E T-28a(+)未检测出㊂证明B V D V E0多克隆抗体具有良好的免疫特异性,可特异性识别B V D V E0蛋白㊂2.4B V D V检测W e s t e r nb l o t t i n g检测B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V在B H K-21细胞内的表达和包装病毒在M D B K细胞内的复制,结果显示均在26k u处出现目的条带(图4A和4B),即为B V D V E0蛋白大小,证明该多克隆抗体可特异性识别细胞表达的E0蛋白㊂通过细胞免疫荧光检测B V D V,结果如图4C所示,E0多克隆抗体组出现荧光,而免疫前血清对照组未出现荧光,表明本试验制备的多克隆抗体可用于B V D V的免疫荧光检测㊂通过双抗夹心法E L I S A检测B V D V,结果如图4D所示,在1ʒ500至1ʒ32000抗血清稀释比范围内, B V D V检测均为阳性,且随着稀释比的升高,P/N 值呈上升趋势㊂以上结果表明,本试验制备的B V D V E0多克隆抗体可特异性识别B V D V E0蛋白,用于B V D V的检测㊂43138期王 炜等:牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备①A ,S D S -P A G E 检测诱导和纯化蛋白;B ㊁C ,W e s t e r nb l o t t i n g 检测诱导和纯化蛋白㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1,pE T -28a (+)未经I P T G 诱导;2,p E T -28a (+)经I P T G 诱导4h ;3,p E T 28a -E 0未经I P T G 诱导;4,p E T 28a -E 0经I P T G 诱导4h ;5,上清;6,沉淀;7,流出液;8,洗脱液;9,E 0纯化蛋白;10,E 0诱导蛋白;11,E 0纯化蛋白①A ,D e t e c t i o no f i n d u c e da n d p u r i f i e d p r o t e i n sb y S D S -P A G E ;Ba n dC ,D e t e c t i o no f i n d u c e da n d p u r i f i e d p r o t e i n sb y We s t e r n b l o t t i n g .②M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,p E T -28a (+)w a sn o t i n d u c e db y I P T G ;2,p E T -28a (+)w a s i n d u c e db y IP T Gf o r4h ;3,p E T 28a -E 0w a s n o ti n d u c e d b y I P T G ;4,p E T 28a -E 0w a si n d u c e d b y I P T G f o r4h ;5,S u p e r n a t a n t ;6,P r e c i p i t a t i o n ;7,E f f l u e n t ;8,E l u e n t ;9,E 0p u r i f i e d p r o t e i n ;10,E 0i n d u c e d p r o t e i n ;11,E 0p u r i f i e d p r o t e i n 图2 E 0蛋白的表达㊁可溶性分析㊁纯化及鉴定F i g .2 E x p r e s s i o n ,s o l u b i l i t y a n a l y s i s ,pu r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fE 0p r o t e in ①A ㊁B ,分别为免疫前血清和B V D V E 0多克隆抗体作为一抗W e s t e r nb l o t t i n g 检测E0纯化蛋白;C ㊁D ,分别为免疫前血清和B V D VE 0多克隆抗体作为一抗W e s t e r nb l o t t i n g 检测大肠杆菌B L 21表达的总蛋白㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1~4,耳标号A 851㊁A 852㊁A 853㊁A 795小鼠免疫前血清;5~8,耳标号A 851㊁A 852㊁A 853㊁A 795小鼠免疫后血清㊂9㊁11,p E T -28a (+)诱导蛋白;10㊁12,pE T 28a -E 0诱导蛋白①Aa n dB ,P r e -i m m u n e s e r u ma n dB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y w e r e u s e d a s p r i m a r y an t i b o d i e s t od e t e c tE 0p u r i f i e d p r o t e i n b y W e s t e r n b l o t t i n g ,r e s p e c t i v e l y ;C a n d D ,P r e -i m m u n es e r u m a n d B V D V E 0p o l y c l o n a la n t i b o d y w e r eu s e da s p r i m a r ya n t ib o d i e s t od e t ec t t h e t o t a l p r o t e i n e x p r e s s ed b y E .c o l i B L 21b y We s t e r n b l o t t i n g ,r e s p e c t i v e l y.②M ,P r o t e i nM a r k e r ;1-4,P r e -i m m u n e s e r u mo fm i c ew i t he a rn u m b e rA 851,A 852,A 853,A 795;5-8,P o s t -i m m u n es e r u m o fm i c ew i t he a rn u m b e rA 851,A 852,A 853,A 795;9a n d11,p E T -28a (+)i n d u c e d p r o t e i n ;10a n d12,p E T 28a -E 0i n d u c e d p r o t e i n 图3 B V D VE 0多克隆抗体特异性检测F i g .3 S p e c i f i c d e t e c t i o no fB V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y5313中 国 畜 牧 兽 医49卷①A ㊁B ,W e s t e r nb l o t t i n g 检测BV D V E 0分别在B H K -21和M D B K 细胞中的表达;C ,细胞免疫荧光检测被B V D V 感染的M D B K 细胞(100ˑ);D ,双抗夹心法E L I S A 检测B V D V ㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1~3,转染p M C 18-B V D V 质粒的B H K -21细胞;4,空白B H K -21细胞,5~7,包装病毒感染的M D B K 细胞;8,空白M D B K 细胞①Aa n dB ,T h ee x p r e s s i o no fB V D V E 0i nB H K -21a n d M D B K c e l l sb y W e s t e r nb l o t t i n g;C ,C e l l u l a r i m m u n o f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o no f M D B Kc e l l s i n f e c t e d w i t hB V D V (100ˑ);D ,D e t e c t i o no fB V D V b y d o u b l ea n t i b o d y s a n d w i c h E L I S A .②M ,P r o t e i n M a r k e r ;1-3,B H K -21c e l l s t r a n s f e c t e dw i t h p M C 18-B V D V p l a s m i d ;4,B l a n kB H K -21c e l l s ;5-7,M D B Kc e l l s i n f e c t e d w i t h p a c k a g i n g v i r u s ;8,B l a n k M D B Kc e l l s 图4 B V D VE 0多克隆抗体检测B V D VF i g .4 D e t e c t i o no fB V D Vb y B V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y2.5 B V D VE 0多克隆抗体效价测定利用E L I S A 法检测制备的B V D V E 0多克隆抗体的效价,如图5所示,A 851小鼠免疫后血清(B V D V E 0多克隆抗体)以1ʒ64000比例稀释时P /N 值仍在2倍以上,并且检测发现4只免疫小鼠抗血清效价均高于1ʒ32000㊂结果证明,本试验制备的B V D V E 0多克隆抗体效价较高㊂63138期王 炜等:牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备图5 B V D VE 0多克隆抗体效价测定F i g .5 T i t e r d e t e r m i n a t i o no fB V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y3 讨 论B V D V 在世界范围内被称为感染反刍动物的非典型瘟病[23],可引起牛慢性持续性感染和急性致死性疾病,死亡率较高[24],对畜牧养殖业造成巨大的经济损失㊂因此快速准确的诊断方法是防控B V D V 的关键㊂B V D V 抗原E L I S A 和实时荧光定量P C R 是检测感染动物的两种最可靠㊁最灵敏的方法,实时荧光定量P C R 在转录水平检测目的基因,涉及R N A 合成过程,操作较复杂;E L I S A 作为蛋白的定量检测,灵敏度高,操作方式灵活,是检测B V D V 最具成本效益的方法[25]㊂在准确检测B V D V 的基础上,研发易于制备且高效价的检测抗体尤为重要㊂B V D V 疫苗和检测抗体研究的主要靶点为E 0和E 2蛋白,B V D V 的包膜蛋白E 0作为宿主抗体应答的主要靶标之一,已逐渐成为抗原蛋白免疫法制备E L I S A 检测等抗体的候选抗原蛋白[18-19]㊂B V D V E 0蛋白是病毒颗粒的重要组成部分,表现出R N a s e 活性,是B V D V 毒力因子形成的关键[26]㊂E 0蛋白通过长的两性螺旋附着在膜上,属于膜锚定的,但没有跨膜肽[17],因此在B V D V 各结构蛋白中,E 0蛋白具有较高的保守性[20]㊂E 0蛋白大小约为26k u ,突变率低,结构稳定,较易表达和纯化,是E L I S A 检测中理想的包被抗原蛋白㊂目前原核表达系统广泛应用于各类病原微生物蛋白的表达[27-28],操作简单且高效,多克隆抗体制备简单㊁成本低㊁应用广泛,已有B V D V E 2等蛋白多克隆抗体的制备㊂但对于B V D V E 0蛋白相关抗体的制备报道较少,因此,本研究选用B V D V E 0蛋白,将其在原核表达系统中表达纯化,免疫小鼠制备B V D V E 0多克隆抗体㊂以纯化的E 0蛋白作为包被抗原,该多克隆抗体可用于B V D V 的E L I S A 检测,同时也可应用于组织及细胞培养中B V D V 感染的检测㊂B V D V E 0多克隆抗体虽然没有单克隆抗体的特异性好,但能与多株B V D V 发生结合反应,在一定程度上克服了B V D V 不同毒株之间抗原多样性问题,检测范围更广㊂本研究首先利用P C R 技术扩增出B V D V E 0基因片段,将其克隆至p E T -28a (+)载体,成功构建pE T 28a -E 0原核表达载体,然后将p E T 28a -E 0转化至大肠杆菌表达菌株B L 21(D E 3),并成功诱导表达E 0蛋白,大小约26k u ,与制备兔抗B V D V E 0多克隆抗体研究中[29]表达出大小约30k u 的B V D V E 0蛋白的结果基本符合㊂经可溶性分析发现,B V D VE 0蛋白主要以包涵体的形式存在㊂采用N iN T Ab e a d s 亲和层析纯化E 0蛋白,并将纯化的E 0蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫小鼠,结果表明,制备的B V D V E 0多克隆抗体具有良好的免疫特异性,可用于W e s t e r nb l o t t i n g ㊁免疫荧光试验㊁E L I S A 等试验检测B V D V ,为后期研制B V D V E L I S A 检测试剂盒提供了抗体㊂并且在双抗夹心法E L I S A 检测B V D V 时发现,B V D V MO I 在0.2~0.4范围内检测效果较好,推测MO I =0.1时病毒粒子较少,而MO I =0.5时病毒粒子已经过饱和㊂值得注意的是,现如今中国的B V D V 防控状况仍十分艰巨,需要高效的疫苗免疫和有效的检测抗体㊂本研究制备的B V D V E 0多克隆抗体为B V D V 的检测奠定了基础,但该多克隆抗体还未进行临床应用,具体使用情况还需进一步研究㊂7313中国畜牧兽医49卷4结论本研究利用原核表达系统在37ħ,1m m o l/L I P T G条件下成功诱导表达B V D V E0蛋白,纯化蛋白免疫小鼠制备出B V D V E0多克隆抗体,该多克隆抗体能特异性识别B V D V及其在细胞内表达的E0蛋白,免疫特异性良好且效价较高,为研究B V D V E0蛋白的结构和功能及B V D V的检测提供了抗体㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]J O K A R M,R A HM A N I A N V,F A R H O O D I M,e ta l.S e r o p r e v a l e n c e o f B o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s(B V D V)i n f e c t i o ni n c a t t l e p o p u l a t i o ni nI r a n:A s y s t e m a t i cr e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i s[J].T r o p i c a l A n i m a lH e a l t h&P r o d u c t i o n,2021,53(5):449.[2] M E RWA I S SF,C Z I B E N E R C,A L V A R E ZD E.C e l l-t o-c e l l t r a n s m i s s i o n i s t h em a i nm e c h a n i s ms u p p o r t i n gB o v i n e v i r a l d i a r r h e av i r u ss p r e a di nc e l l c u l t u r e[J].J o u r n a l o f V i r o l o g y,2019,93(3):e01776-18. [3]中华人民共和国农业部公告第九十六号[J].农村养殖技术,1999,5:28.A n n o u n c e m e n tN o.96o f t h e M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r eo f t h e P e o p l e sR e p u b l i c o f C h i n a[J].R u r a l B r e e d i n gT e c h n o l o g y,1999,5:28.(i nC h i n e s e)[4] M I L I'C E V I'CV,M A K S I M O V I'C-Z O R I'CJ,V E L J O V I'CL,e ta l.B o v i n e v i r a ld i a r r h e a v i r u si nf e c t i o ni n w i l db o a r[J].R e s e a rc hi n V e t e r i n a r y S c i e n c e,2018,119:76-78.[5]I O T T IB,V A L D A N O E,S A V I N I L,e t a l.F a r mp r o d u c t i v e c o n t e x t sa n dt h ed y n a m i c so fB o v i n ev i r a ld i a r r he a(B V D)t r a n s m i s s i o n[J].P r e v e n t i v eV e t e r i n a r yM e d i c i n e,2019,165:23-33.[6] W A L Z P H,C H A M O R R O M F,F A I L E N B E R GS M,e t a l.B o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s:A n u p d a t e dA m e r i c a n c o l l e g e o f v e t e r i n a r y i n t e r n a l m e d i c i n ec o n s e n s u ss t a t e m e n t w i t h f o c u s o n v i r u s b i o l o g y,h o s t s,i m m u n o s u p p r e s s i o n,a n d v a c c i n a t i o n[J].J o u r n a l o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e,2020,34(5):1690-1706.[7] B E C H E RP,T H I E L H J,C O L L I N S M,e ta l.C e l l u l a rs e q u e n c e s i n p e s t i v i r u s g e n o m e s e n c o d i n g g a m m a-a m i n ob u t y r i cac i d(A)r e c e p t o r-a s s o c i a t ed p r o te i na n dG o l g i-a s s o c i a t e dA T P a s ee n h a n c e ro f16k i l o d a l t o n s[J].J o u r n a l o f V i r o l o g y,2002,76(24):13069-13076. [8] R I D P A T H J F,B O L I N S R,D U B O V I E J.S e g r e g a t i o n o f B o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s i n t og e n o t y p e s[J].V i r o l o g y,1994,205(1):66-74.[9] D AS I L V A CPV,A L V E S M F,D ES O U Z A N M M,e t a l.Ef f e c t so fo o c y t e se x p o s u r et o B o v i n ed i a r r h e av i r u s e sB V D V-1,B V D V-2a n d H o b i-l i k e v i r u s o ni nv i t r o-p r o d u c e d b o v i n e e m b r y o d e v e l o p m e n t a n d v i r a li n f e c t i o n[J].T h e r i o g e n o l o g y,2017,97:67-72.[10] R I D P A T HJF,B E N D F E L D T S,N E I L LJD,e ta l.L y m p h o c y t o p a t h o g e n i c a c t i v i t y i n v i t r o c o r r e l a t e sw i t hh i g hv i r u l e n c e i n v i v o f o rB V D Vt y p e2s t r a i n s:C r i t e r i a f o r a t h i r d b i o t y p e o f B VD V[J].V i r u sR e s e a r c h,2006,118(1-2):62-69.[11]朱礼倩,周艳君,于海,等.牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析[J].中国动物传染病学报,2011,19(5):83-86.Z HU L Q,Z H O U Y J,Y U H,e ta l.T h ec u r r e n tp r e v a l e n c e s t a t u s o f B V D V i n C h i n a[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f Z o o l o g i c a l I n f e c t i o u s D i s e a s e s,2011,19(5):83-86.(i nC h i n e s e)[12] P E C O R A A,A G U I R R E B U R U A L D E M S,A G U I R R EB U R U A L D E A,e ta l.S a f e t y a n de f f i c a c yo fa n E2g l y c o p r o t e i n s u b u n i tv a c c i n e p r o d u c e di nm a m m a l i a n c e l l s t o p r e v e n t e x p e r i m e n t a li n f e c t i o nw i t h B o v i n e v i r a l d i a r r h o e a v i r u s i n c a t t l e[J].V e t e r i n a r y R e s e a r c h C o m m u n i c a t i o n s,2012,36(3):157-164.[13] B A X I M K,D E R E G T D,R O B E R T S O N J,e ta l.R e c o m b i n a n t B o v i n e a d e n o v i r u s t y p e3e x p r e s s i n gB o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s g l y c o p r o t e i nE2i n d u c e s a ni m m u n er e s p o n s ei nc o t t o nr a t s[J].V i r o l o g y,2000,278(1):234-243.[14] M I R O SŁAW P,P O L A K M P.V a r i a b i l i t y o f E2p r o t e i n-c o d i n g s e q u e n c e s o f B o v i n e v i r a l d i a r r h e av i r u s i nP o l i s hc a t t l e[J].V i r u sG e n e s,2020,56(4):515-521.[15] T A N GF,Z HA N G C.E v i d e n c e f o r p o s i t i v es e l e c t i o no nt h e E2g e n eo fB o v i n ev i r a ld i a r r h o e av i r u st y p e1[J].V i r u sG e n e s,2007,35(3):629-634.[16] T E W SBA,M E Y E R SG.T h e p e s t i v i r u s g l y c o p r o t e i nE r n s i sa n c h o r e di n p l a n ei nt h e m e m b r a n e v i a a na m p h i p a t h i c h e l i x[J].T h e J o u r n a l o f B i o l o g i c a lC h e m i s t r y,2007,282(45):32730-32741.[17] T E W S B A,K L I N G E B E I L A,KÜHN J,e ta l.T h eE r n s C a r b o x y t e r m i n u s:M u c h m o r et h a na m e m b r a n ea n c h o r[J].V i r u s e s,2021,13(7):1203.[18] S E L I GMA N SJ,B U C H E R D J.T h ei m p o r t a n c eo fb e i n g o u t e r:C o n s e q u e nc e so f t h ed i s t i n c t i o nbe t w e e nt h e o u t e r a n d i n n e r s u r f a c e s o f f l a v i v i r u s g l y c o p r o t e i nE[J].T r e n d s i n M i c r o b i o l o g y,2003,11(3):108-110.[19] F U L T O N R W,S T E P D L,R I D P A T H JF,e ta l.83138期王炜等:牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备R e s p o n s e o f c a l v e s p e r s i s t e n t l y i n f e c t e d w i t hn o n c y t o p a t h i cB o v i n ev i r a ld i a r r h e av i r u s(B V D V)s u b t y p e1b a f t e r v a c c i n a t i o nw i t hh e t e r o l o g o u sB V D Vs t r a i n s i nm o d i f i e d l i v e v i r u s v a c c i n e s a n dM a n n h e i m i ah a e m o l y t i c ab a c t e r i n-t o x o i d[J].V a c c i n e,2003,21(21-22):2980-2985.[20] S E Y F IASM R,E K H T E L A T M,G H O R B A N P O O RN A M,e ta l.P r o d u c t i o n o f m o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t r e c o mb i n a n t p o l y p e p t i d e f r o mt h e e r n sc od i n gr e g i o n o f t h eB o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s[J].J u n d i s h a p u rJ o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y,2015,8(12):e26727.[21] M I S C H L E R M,M E Y E R SG.T h em o l e c u l a r b a s i s f o rE r n s d i m e r i z a t i o ni n c l a s s i c a lS w i n ef e v e rv i r u s[J].V i r u s e s,2021,13(11):2204.[22] L U S S I C,D E M A R T I NE,S C HW E I Z E R M.P o s i t i v e l yc h a r g e da m i n oa c id s i nt he p e s t i v i r a lE r n s c o n t r o l c e l le n t r y,e n d o r i b o n u c l e a s ea c t i v i t y a n di n n a t ei m m u n ee v a s i o n[J].V i r u s e s,2021,13(8):1581.[23] O㊅G U Z O㊅G L U T,K OBT,C OŞK U N N,e t a l.E n d l e s sv a r i e t y f o r B o v i n e v i r u s d i a r r h e a v i r u s e s:N e wm e m b e r s o f an o v e l s u b g r o u p i n t oP e s t i v i r u sAf r o mT u r k e y[J].T r o p i c a lA n i m a lH e a l t h&P r o d u c t i o n,2019,51(5):1083-1087.[24] C O L L O F F A,W A T S O N P,P A U L D U F F J,e ta l.H a e m o r r h a g i cd i s e a s e i nc a t t l e w i t h g e n o t y p e1B o v i n ev i r a l d i a r r h o e a v i r u s i n f e c t i o n[J].T h e V e t e r i n a r yR e c o r d,2012,171(21):530.[25] Q U I N E T C,C Z A P L I C K I G,D I O N E,e ta l.F i r s tr e s u l t s i nt h eu s eo fb o v i n ee a rn o t c ht a g f o rB o v i n ev i r a l d i a r r h o e a v i r u s d e t e c t i o n a n d g e n e t i ca n a l y s i s[J].P L o SO n e,2016,11(10):e0164451.[26] T U C A K O V A K,Y A V U ZS,S C H R MA N N E M,e t a l.R e s t o r a t i o nofg l y c o p r o t e i nE r n s d i m e r i z a t i o n v i ap s e u d o r e v e r s i o n p a r t i a l l y r e s t o r e s v i r u l e n c e o fC l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s[J].T h e J o u r n a l o fG e n e r a lV i r o l o g y,2018,99(1):86-96.[27]蒋亚君,陈世钰,鑫婷,等.非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备[J].中国畜牧兽医,2022,49(1):352-360.J I A N G Y J,C H E N S Y,X I N T,e ta l.P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n of A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s360-12Lp r o t e i na n d p r e p a r a t i o no f i t s p o l y c l o n a l a n t i b o d y[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2022,49(1):352-360.(i nC h i n e s e)[28]刘雪婷,王召阳,鑫婷,等.非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定[J].中国畜牧兽医,2021,48(3):991-1000.L I U X T,WA N G Z Y,X I N T,e ta l.P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a n d p o l y c l o n a la n t i b o d y p r e p a r a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n o f A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s B438Lp r o t e i n[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2021,48(3):991-1000.(i nC h i n e s e) [29]王雪枝,朱远茂,史鸿飞,等.牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的表达与多克隆抗体制备[J].黑龙江畜牧兽医,2014,5:4-8.WA N GXZ,Z HU M Y,S H IHF,e t a l.E x p r e s s i o n o ft h e E0p r o t e i n o f B o v i n e v i r a ld i a r r h e a v i r u s a n dp r e p a r a t i o no fi t s p o l y c l o n a la n t i b o d y[J].H e i l o n g j i a n gA n i m a lS c i e n c ea n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2014,5:4-8.(i nC h i n e s e)(责任编辑戴晔)9313。

pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的开题报告一、研究背景XBP1（X-box binding protein 1）是一种在细胞内负责调节内质网（ER）应激反应的转录因子，在内质网应激（ER stress）发生时能够通过非常规剪切的方式产生活性的转录因子形式（XBP1u），并进一步调节众多靶基因的表达，以保证机体能够有效地适应外界环境的变化。

由于XBP1在疾病发生发展过程中起着重要的作用，因此对其进行深入的研究具有重要的意义。

而构建pET32a-XBP1u质粒系统并进行原核表达、纯化以及多克隆抗体制备是进行深入研究的前提和基础。

因此，本研究计划对pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备进行探究。

二、研究目的1. 利用pET32a-XBP1u质粒系统成功进行XBP1u的原核表达，并进行相关酶学检测和分析；2. 通过一系列的纯化步骤，获得高纯度的XBP1u蛋白；3. 制备高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，并进一步验证其特异性和识别能力。

三、研究内容及方法1. 构建pET32a-XBP1u质粒系统：对XBP1u编码区域的序列进行合成、克隆和验证，构建成pET32a-XBP1u质粒系统。

2. 原核表达和酶学活性检测：将pET32a-XBP1u质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况，并通过酶学检测法分析蛋白的酶活性。

3. 蛋白的纯化：通过多步纯化，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，获得高纯度的XBP1u蛋白。

4. 抗体制备：利用高纯度的XBP1u蛋白免疫小鼠，产生多克隆抗体。

通过酶联免疫吸附实验（ELISA）和Western blot验证抗体特异性和识别能力。

四、研究意义1. 通过pET32a-XBP1u的构建和蛋白的表达，为深入研究XBP1u的分子机制提供了基础；2. 通过纯化获得高纯度的XBP1u蛋白，为后续的酶学研究、体外结合实验和晶体结构分析提供了可靠的物质基础；3. 成功制备出高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，为进一步研究XBP1u在疾病发生发展过程中的作用提供了可靠的试剂基础。

对虾白斑综合症病毒（wssv）衣壳蛋白VP28纯化与多克隆抗体的制备第一阶段基因的试表达（寻找最适的IPTG浓度，培养温度）第一天晚上1.挑菌挑取含有pet-30A-vp28重组质粒的菌株，接种于5mL加有卡那霉素（终浓度100ug/ml）的LB培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，调节pH至7.5(进口试剂不用调节pH)中,37℃、220r/min振荡过夜培养，作为母液。

第二天上午2.转培养和IPTG诱导a)从母液中按1:100比例取出菌液，接种于5ml LB液体培养基（含卡那霉素, 终浓度100ug/ml）中转培养，接四管（分别标记0,0.3,0.6,0.9mM，然后每组选择一个温度，例如25,29,33,37℃，及共摇菌16管），培养3-3.5小时至OD值0.8-1.0。

b)然后向菌液中加IPTG至终浓度为0，0.3,0.6,0.9mM，然后每组在各自选定的温度振荡诱导表达8h。

第二天晚上c）6000rpm 离心10min收集菌体，重悬于0.5ml预冷的PBS，加入5ul 20%的Triton X-100,充分混匀后用超声破碎细胞，循环为：超声1s；间隔2s;全程1h。

超声过程中将菌液至于冰浴条件下，避免局部温度过高而使蛋白变性。

d）留全蛋白0.1ml待跑胶是取用，将其余破碎后的菌液10000rpm离心20min，收集上清液和沉淀（沉淀用0.3ml PBS重悬），分别留样（每组会有8个样，分别标记为0-s,0-p,0.3-s,0.3-p,0.6-s,0.6-p,0.9-s,0.9-p）-20℃存放，留待SDS-PAGE检测。

第三天（可不连续）3. 电泳检测a)将玻璃板洗净，晾干，固定在电泳槽中，灌入去离子水以检测是否漏水。

b)根据表达蛋白的大小（VP28 28kDa）配制一定浓度的分离胶（12.5%）。

c)立即将配制好的分离胶沿着边缘缓慢加入玻璃夹层中，注意不要产生气泡，加至距离玻璃板顶端1.5-2cm处，在上面覆盖一层蒸馏水或30%乙醇封胶，使凝胶表面变得平整，静放大约1-2h，使凝胶聚合，聚合后，会在分离胶和水层出现一个清晰的界面,此时抬起电泳槽的一侧水层流动而胶不会流。

中国生物工程杂志 Ch i n a B iotechnology ,2010,30(10):7 11LI NE 1编码蛋白L1 ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备*胡明明1,2朱运峰1**王 越2 王 宇2 张 亮2 高旭东1 董金凯3 于继云2**(1军事医学科学院附属医院 北京 100071 2军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850)(3中国人民解放军总医院 北京 100853)摘要 目的:制备具有肿瘤组织特异性表达的L1 ORF1蛋白多克隆抗体并进行初步应用研究。

方法:采取基因工程表达方法制备L1 ORF1蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELI SA 检测抗体效价,W estern blot 和细胞免疫荧光方法检测抗体特异性,免疫检测验证其识别肿瘤细胞内L1 ORF1蛋白的特异性。

结果:制备的抗L1 ORF1蛋白多克隆抗体具有很高的敏感性与特异性,免疫学检测表明该抗体不仅能检测出正常细胞中瞬时表达的L1 ORF1蛋白,而且可检测出肿瘤细胞中天然表达的L1 ORF1蛋白。

结论:制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性,为以后该抗体的进一步应用奠定了基础。

关键词 L1 ORF1p 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 间接免疫荧光中图分类号 R730.21收稿日期:2010 06 07 修回日期:2010 07 08*国家科技重大专项基金(2008ZX10002 003)、国家自然科学基金(30772002)资助项目**通讯作者,电子信箱:z huyf 2004@163.co m;yujyun @126.co mL I NE (long interspersed nuclear ele m e nts ,L1)长散布核元件,是人类基因组中重要的重复序列,L I NE1(L1)为主要的L I NEs 序列,占人类基因组的17%。

L1通过转座,在人类基因组中获得多达10万份的拷贝数[1]。

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定作者：黄博, 于芳, 王孝功, 白丽圆, 李华, 卢兹凡【关键词】 QKI［摘要］目的: 获得原核表达的RNA结合蛋白QKI7蛋白, 并制备其兔抗QKI多克隆抗体。

方法: 将成功插入QKI7编码区cDNA 的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3) 感受态细菌, 以IPTG诱导6×HisQKI7融合蛋白的表达, 分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。

经SDSPAGE和Western blot 鉴定后, 应用纯化的融合蛋白, 分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并以Western blot进行检测。

结果: 经表达并纯化的QKI7蛋白纯度达到95%以上, 应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度, 特异性的抗QKI的多克隆抗体。

结论: 成功地表达并纯化了QKI7蛋白, 并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。

采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC 膜。

[关键词]QKI7; 原核表达; 蛋白纯化; 多克隆抗体QKI是属于STAR家族的一种RNA结合蛋白,在进化过程中高度保守, 在神经系统的髓鞘形成、胚胎发育、心血管系统的发育等方面起着重要的作用。

qki基因不同部位的突变体小鼠可以表现在出生前死于心血管肌肉系统发育障碍, 或于出生后10 d表现为快速的震颤以及到了成年强直性惊厥的发作[1-3]。

Pilotte 等[4]发现QKI7可以引起成纤维细胞和原代培养的大鼠少突胶质细胞发生凋亡, QKI5 和QKI6不但不能诱导凋亡, 反而可以与QKI7形成二聚体, 并转移到细胞核内, 抑制QKI7的致凋亡作用。

为了研究QKI在外界不同信号刺激下在炎症发生、血管生成过程中表达水平的变化, 我们表达和纯化了6×HisQKI7融合蛋白, 并制备了高特异性的多克隆抗体[5]。