医学免疫学实验课件-实验三 细菌的人工培养

《医学免疫学与微生物学》实验报告实验一【实验名称】：沉淀反应［实验目的］：通过单向琼脂扩散测定待测血清ig含量【实验材料】：1%离子琼脂、白喉类毒素、白喉抗毒素、玻片、毛细管移液管打孔器【试验步骤】：（1）将溶解的离子琼脂冷却至450℃，加入适当浓度的抗原混合均匀，吸取３－４毫升加在载玻片上，使其均匀布满载玻片而又不流失。

（2）琼脂被固化并制成凝胶板，然后在适当的距离穿孔。

（3）将待测可溶性抗体滴入孔中。

（４）将凝胶平板放入带盖瓷盘中，下面垫一湿纱布以保持湿度，置于在370C培养箱中观察沉淀环24小时。

［实验结果］：（沉淀环直径）测量沉淀环直径：mm。

［实验分析］单向琼脂扩散是一种定量试验，主要用来测定标本中各种免疫球蛋白色或补体成分的含量。

在孔中加入待测抗体使其向四周扩散，经一定时间后抗体与琼脂中当抗原相遇时，以适当的比例形成白色沉淀环。

沉淀环直径与抗体浓度成正比。

根据测试样品沉淀环直径的大小，可从已知的标准曲线中查出样品中抗体的含量。

第1页，共6页实验二【实验名称】：间接凝集抑制试验（妊娠试验）［实验目的］：测定待检尿液中是否含ｈｃｇ（绒毛膜促性腺激素）以诊断妊娠［实验材料］：孕妇尿液、非孕妇尿液、ｈｃｇ致敏乳胶抗原、抗ｈｃｇ血清、载玻电影等［试验步骤］：（1）做一张幻灯片，在左右两边做标记。

（２）在载玻片左侧加一滴待检尿液，右侧加一滴非孕妇尿液。

（３）在两侧尿液中分别加一滴抗ｈｃｇ血清，摇动混匀２－３分钟。

（４）在两侧液滴中分别再加一滴ｈｃｇ致敏乳胶抗原，摇动混匀２－３分钟。

（５）观察判定结果。

[实验结果]（关于凝集和非凝集的描述）左侧（待检尿液侧）呈现均匀的乳状液状态，无凝集颗粒。

间接凝集抑制阳性。

右测（非孕妇尿液侧）出现明显的凝集颗粒。

间接凝集抑制阴性。

［实验分析］：（结合实验原理）孕妇尿液中hCG含量显著升高。

尿液中的hCG与添加的抗hCG结合，消耗抗hCG，使添加的hCG乳胶抗原不再与抗hCG结合，乳胶抗原无间接凝集反应（凝集被抑制）。

实验一［实验名称］：沉淀反应［实验目的］：通过单向琼脂扩散测定待测血清Ig含量［实验材料］：１％离子琼脂、白喉类毒素、白喉抗毒素、载玻片、毛细吸管打孔器［试验步骤］：（１）将溶解后的离子琼脂冷却到４５０Ｃ，加入适当浓度的抗原混合均匀，吸取３－４毫升加在载玻片上，使其均匀布满载玻片而又不流失。

（２）琼脂凝固后制成凝胶板，然后隔适当距离打孔。

（３）在孔内滴加待测可溶性抗体。

（４）将凝胶平板放入带盖瓷盘中，下面垫一湿纱布以保持湿度，置于３７０Ｃ恒温箱中２４小时，观察沉淀环。

［实验结果］：（沉淀环直径）测量沉淀环直径：毫米。

［实验分析］单向琼脂扩散是一种定量试验，主要用来测定标本中各种免疫球蛋白或补体成分的含量。

在孔中加入待测抗体使其向四周扩散，经一定时间后抗体与琼脂中抗原相遇，在比例适宜处生成白色沉淀环。

沉淀环直径与抗体浓度成正比。

根据测试样品沉淀环直径的大小，可从已知的标准曲线中查出样品中抗体的含量。

实验二［实验名称］：间接凝集抑制试验（妊娠试验）［实验目的］：测定待检尿液中是否含ＨＣＧ（绒毛膜促性腺激素）以诊断妊娠［实验材料］：孕妇尿液、非孕妇尿液、ＨＣＧ致敏乳胶抗原、抗ＨＣＧ血清、载玻片等［试验步骤］：（１）取一片载玻片，标记出左右。

（２）在载玻片左侧加一滴待检尿液，右侧加一滴非孕妇尿液。

（３）在两侧尿液中分别加一滴抗ＨＣＧ血清，摇动混匀２－３分钟。

（４）在两侧液滴中分别再加一滴ＨＣＧ致敏乳胶抗原，摇动混匀２－３分钟。

（５）观察判定结果。

［实验结果］：（凝集和非凝集的描述）左侧（待检尿液侧）呈现均匀的乳状液状态，无凝集颗粒。

间接凝集抑制阳性。

右测（非孕妇尿液侧）出现明显的凝集颗粒。

间接凝集抑制阴性。

［实验分析］：（结合实验原理）孕妇尿液中的ＨＣＧ含量显著增高。

尿液中的ＨＣＧ与加入的抗ＨＣＧ结合，抗ＨＣＧ被消耗，使得加入的ＨＣＧ乳胶抗原不能再与抗ＨＣＧ结合，不出现乳胶抗原间接凝集反应（凝集被抑制），所以液滴呈现均匀乳状液，为乳胶间接凝集抑制阳性反应。

《医学微生物学》细菌的人工培养实验[目的]1．掌握平板划线法、斜面、液体和半固体培养基等各种接种方法。

2．掌握接种细菌用具、接种细菌的环境要求和无菌操作要领。

3．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。

4．熟悉细菌和二氧化碳培养方法。

5．熟悉常用的厌氧菌培养技术。

6．了解培养基制备的基本过程。

[内容]（一）、培养基制备技术[材料]1．试剂：牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、抗凝绵羊血、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、硝酸钾、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、硫酸。

亚铁、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、酚红、lmol ／L NaOH、lmol／L HCl。

2．器材：500ml锥形瓶、500ml量筒、10ml、5ml和lml吸管、精密pH试纸、华氏试管、硅胶塞、天平、高压蒸气器、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。

[方法]1．培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。

（1）调配成分：按培养基组成准确称取各成份用量，放入锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。

应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。

（2）溶解：将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸气灭菌器中，使其完全溶解。

不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中含铜量超过0.3mg／L时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg／L时可抑制细菌毒素的产生。

（3）矫正pH：一般将培养基的pH调至7.2～7.6左右。

经高压灭菌后其pH可发生0.1～0.2变动。

若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.1～0.2；若用Na2CO3矫正，高压灭菌后pH升高0.1～0.2。

（4）滤过澄清：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。

液体或半固体培养基常用滤纸过滤；固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。

（5）分装：①基础培养基：一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；②琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端1cm柱高；③半固体培养基：分装量为试管量的1/4-1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固④琼脂高层培养基：分装量为管长的2/3(接种厌氧菌用)，灭菌后趁热直立凝固；⑤琼脂平板无菌分注：先将灭菌琼脂熔化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径90mm的平皿约13～15min)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。