多肽蛋白质N-端序列分析

N端序列分析Edman降解（埃德曼降解）法，是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）首先创立用于肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析的方法。

Edman降解法检测的原理非常简单，在碱性条件下反应，用异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, PITC）与待检测的蛋白质（多肽）的N-端氨基生成苯氨基硫甲酰（PTC）的衍生物，然后处理-关环-选择性切断肽链N-端，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。

接着用有机溶剂萃取衍生物，在酸的作用下，不稳定的衍生物转变为稳定的的乙内苯酰硫脲（PTH）衍生物，余下肽链中的酰胺键不受影响。

通过用HPLC或电泳法分析生成的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），可以鉴定出氨基酸类别。

重复氨基酸鉴定反应可以达到对N端氨基酸按照从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。

对于序列较长的蛋白质（多肽），还可以将样品先切成小的肽段，先对肽段序列分析，再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。

蛋白质N端测序流程。

Edman降解法用于N端测序的优点：1. PITC与所有氨基酸残基的反应产率和回收率高，因此副产物少，可通过色谱进行准确鉴定；2. 反应时间快，对于大多数氨基酸残基来说，30min耦合时间，5min切割反应时间即可；3. 反应后的肽链仍然是完整的，可用Edman降解法重复测定新生的N末端氨基酸。

Edman降解法用于N端测序需要注意的问题：1. 样品纯度需>90%，盐离子含量在50 mmol/L之内，不含SDS等变性剂，N端必须是均一的高纯样品；2. 10 Pmol 样品可以测定20 aa；3. 液体样品不能含有蛋白酶，建议尽早测试，防止时间太长容易降解；4. 转膜样品在转膜前不宜放置太久以防样品扩散，转膜后可密封保存3-6个月，建议使用Coomassie R-250进行染色，电泳缓存液建议使用CAPS buffer；5. 样品无信号峰是，建议蛋白进行N-端封闭；6. 建议整个反应过程中尽可能使用高纯buffer。

蛋白质n端测序原理
蛋白质N端测序是一种常用的方法，用于确定蛋白质的氨基酸组成和序列。

该方法的原理基于蛋白质N端的氨基酸序列独特性。

首先，需要将要测序的蛋白质通过一系列的分离和纯化步骤获得较高纯度的蛋白质样品。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或高效液相色谱等技术来实现。

接下来，将蛋白质样品进行水解，常见的方法是利用酶或酸来将蛋白质水解为一系列短肽。

常用的酶包括胰蛋白酶和氨基酸脱肽酶。

然后，水解产物中的短肽将通过逐步分离和纯化的方法，以便将它们分离为尽可能单一的肽段。

之后，这些肽段将通过质谱仪进行质谱分析。

在质谱分析中，肽段将被离子化并通过质谱仪中的引导电场进行加速。

在质谱仪的分析部分，质谱仪会根据肽段的质量和电荷比进行测量，并生成质谱图。

通过解读质谱图，可以确定肽段的氨基酸组成和序列。

在质谱图中，每个肽段将对应一个峰，其质量由质谱仪测得。

通过对这些质量峰进行识别和碎片质谱分析，可以获得蛋白质N端的氨基酸序列。

总之，蛋白质N端测序的原理是通过分离、水解、质谱分析
和解读质谱图，来确定蛋白质N端的氨基酸组成和序列。

该方法在蛋白质研究中具有重要的应用价值。

多肽n端为q -回复多肽n端为q，是指多肽分子中的氨基酸序列的N-末端，其中以氨基酸q为起点。

多肽是由两个或更多氨基酸残基连接而成的生物大分子，广泛存在于细胞内外的生物体中。

多肽的序列决定了其所具有的生物学功能和结构性质。

本文将从多肽的合成、结构和功能等方面详细介绍多肽n端为q的相关内容。

首先，多肽的合成是研究多肽n端为q的基础。

多肽的合成是通过连接氨基酸残基的方式进行的。

常用的合成方法有固相合成和液相合成。

固相合成是将C-末端的氨基酸残基连接在固相上，然后通过一系列的反应和洗脱步骤，逐渐扩大多肽链的长度。

液相合成则是在溶液中进行多肽的合成反应，通过对溶液中的氨基酸和偶联试剂进行反应，逐渐形成多肽链。

多肽的结构与其生物学功能密切相关。

多肽的结构主要分为原生结构、一级结构、二级结构和三级结构。

原生结构指的是多肽在生物体内的天然形态，其结构可以通过高分辨率的技术如核磁共振等来确定。

一级结构是指多肽链上氨基酸残基的排列顺序，通过这个顺序可以确定多肽链的序列。

二级结构是指多肽链上氨基酸之间的氢键和其他非共价键的作用，包括α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构。

三级结构是指多肽链上各个氨基酸残基之间形成的空间结构，通常由二级结构的排列组合和其他非共价键的作用决定。

多肽的功能多种多样，与其结构密切相关。

多肽作为生物体内重要的信号分子，具有多样的生物学功能。

例如，神经肽在神经传递中发挥重要作用，如神经肽Y、神经肽P等参与了疼痛传导和食欲调节等功能。

激素多肽如胰岛素、生长激素等则参与了正常的代谢和生长发育过程。

抗菌肽如防御素则是机体免疫系统中一种抑制微生物生长的重要组成部分。

此外，还有一些多肽参与了细胞间的信号传导、细胞黏附等功能。

多肽n端为q所表示的特定序列，可能影响多肽的结构和功能。

每个氨基酸残基在多肽链中都有不同的性质，包括电荷、极性、大小和疏水性等。

因此，多肽n端为q可能会影响多肽的溶解性、稳定性和生物活性等特性。

第十章蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。

在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。

除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。

常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。

蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。

在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。

因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。

§10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。

§10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。

近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。

常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。

茚三酮在酸性（pH = 3 ~ 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）：(10.1)除了-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，-，-，-和-氨基酸比-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm ）。

百泰派克生物科技n端测序和c端蛋白质是由氨基酸脱水缩合组成的链状大分子化合物，含有两个游离的末端，即氨基端（N端）和羧基端（C端）。

蛋白质的C端和N端有着特殊的意义，研究表明蛋白质N端序列与蛋白质的寿命和亚细胞器定位等有密切关系；C端序列影响蛋白质和多肽的空间结构和生物功能。

蛋白质C端和N端测序研究有利于分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。

蛋白质的N末端指氨基（-NH2）端，是蛋白质合成的起始端。

蛋白质N末端测序就是对N-末端的氨基酸种类和排列顺序进行准确分析。

随着生命科学研究和测序技术的发展，蛋白质末端序列的分析方法也不断更新、进步。

目前，测定蛋白质或多肽N末端的方法主要有Sanger法、酶降解法、Edman法、二硝基氟苯法（FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）和基于质谱的方法，其中Edman法和质谱法在N末端序列分析中应用最广。

目前，C末端测序技术还不够成熟，常用的蛋白质C端测序方法主要有羧肽酶法、化学法和串联质谱法等。

羧肽酶法和化学法的策略是通过酶解法或化学试剂裂解法获得C端氨基酸，再结合液相色谱或质谱技术对氨基酸种类进行鉴定。

串联质谱法测定蛋白质 C端序列的原理是将蛋白质样品酶解、消化成肽段混合物，然后对肽段混合物进行串联质谱分析，通过一级质谱信息选择C端肽段离子进行二级质谱分析，再根据二级质谱数据结合相应软件和数据库计算蛋白质的C端氨基酸序列。

百泰派克生物科技提供基于质谱法和Edman降解法的蛋白质C端和N端测序一站式科研技术服务，用于蛋白或活性多肽C/N端序列分析，还可用于确认重组蛋白表达情况，如是否完整表达、表达过程是否发生断裂以及C/N端序列是否发生修饰等。

百泰派克生物科技还可根据需求提供定制化技术服务，欢迎免费咨询。

百泰派克生物科技
多肽氨基酸序列分析
多肽的氨基酸序列分析就是对组成多肽的氨基酸种类、数量以及排列次序进行鉴定，也称为多肽测序，属于多肽一级结构鉴定的内容。

目前较常用的多肽氨基酸序列分析方法包括经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法以及新兴的质
谱法等。

Edman降解法主要是对多肽的N末端氨基酸序列进行分析，但是其对N末端封闭的
肽链无能为力。

此外，Edman降解法测序速度较慢、样品用量较大、样品纯度要求
很高，而且对发生修饰的氨基酸残基识别的准确性不高。

C末端测序法在寻找理想
的PITC化学探针方面仍面临着很大的困难。

在这种背景下，高分辨率（达fmol 级）、高准确性以及操作简便的质谱测序技术则备受青睐，质谱分析技术的灵敏度
及准确性与待测物的分子质量成负相关，分子量增大时检测结果的准确性明显降低，多肽的分子量相比蛋白质小得多，因此采用质谱进行多肽氨基酸序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC
纳升色谱，提供高效精准的蛋白/多肽氨基酸序列分析服务技术包裹，可对各种蛋
白/多肽样品的一级结构进行解析，包括多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
以及多肽链内或链间二硫键的位置和数目等，欢迎免费咨询。

质谱法N端序列分析质谱法N端序列分析是一种利用质谱技术高效、准确地测定蛋白质/多肽N端的氨基酸序列的方法。

由于其高灵敏度、高分辨率和高通量的优点，可用于分析复杂的蛋白质/多肽混合物，以及鉴定修饰、突变以及其他序列变异。

与传统的Edman降解法相比，质谱法具有更高的通量和灵敏度，能够分析更复杂的样品和较大的蛋白质。

基于高分辨质谱法的N端测序，样品经过SDS-PAGE分离目标蛋白后使用蛋白酶酶解，酶解后的产物用Q-Exactive系列质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行质谱分析，肽段在质谱中碎裂得到b、y离子的二级质谱图，通过图谱与蛋白理论氨基酸序列比对确定蛋白质的N端位置。

百泰派克生物科技BTP结合高效液相色谱仪和高分辨质谱，基于N端测序原理，建立了基于质谱法的N端序列分析平台，百泰派克生物科技通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证；为您提供高质量的质谱法N端序列分析服务，我们采用两种不同的蛋白酶切方式，产生两个长度不同的N端肽段，相互验证最终确定蛋白N端序列。

欢迎免费咨询，了解更多详情！质谱法N端序列分析两种酶切方式对比。

实验仪器高效液相色谱串联质谱仪：高效液相色谱仪-Easy-nLC 1200。

电喷雾-组合型离子阱Orbitrap 质谱仪-Q Exactive™ Hybrid。

Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。

技术优势基于高分辨质谱法的N端测序，可以通过高分辨率质谱分析N端封闭和翻译后修饰(PTMs)，从而确定蛋白质N端起点；对于复杂的蛋白，我司支持对复杂蛋白进行N端二甲基化标记，通过分析标记位置确定复杂蛋白样品中的多个蛋白的N端起点。

案例示意蛋白药物样品的N端氨基酸序列分析：Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后得到质谱数据，质谱数据经过与理论数据库匹配，得到和理论N端序列（HYAHVDCPGHADYVK）相符合的MS2图谱，图谱如下：N端序列二级质谱图。

蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。

很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。

5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。

常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。

反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。

羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。

Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。

胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。