苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究

第26卷 第4期2004年7月北 京 林 业 大 学 学 报JOURNAL OF BEIJING FORES TRY UNIVERSITYVol.26,No.4Jul.,20042003 04 23收稿http: *教育部博士点基金项目 苦瓜花发育相关基因(MADS box GENE)的克隆及表达 (2002061088)的部分内容.第一作者:杨满业,博士.主要研究方向:植物分子生物学. 地址:610064成都四川大学生命科学学院.责任作者:陈放,教授.主要研究方向:分子生物学.Email:Cherg fang@s 地址:同上.苦瓜MADS 盒基因的克隆和表达研究*杨满业1)赵茂俊2)徐 莺1)唐 琳1)白 洁1)陈 放1)(1四川大学生命科学学院 2四川农业大学基础部)摘要 根据MADS box 基因保守区结构,设计简并性引物,利用3!RACE 方法,从苦瓜(Momordica charantia L.)中分离出花特异表达基因的cDNA 片段.同时利用5!RACE 方法获得了全长cDNA,命名为BAG .序列分析表明,该cDNA 全长1001bp,含一个编码228个氨基酸的完整开放阅读框,5!端和3!端非翻译区分别为50、267个碱基,poly (A)尾巴长22个核苷酸,具有典型的植物MADS box 基因的结构.该基因编码的蛋白质与黄瓜(CUM10,CAG1),棉花(GH MADS 2),以及拟南芥AGL11等MADS 盒基因蛋白质的同源性分别为:95%、93%、84%、72%.Southern 杂交分析显示,在基因组中至少有两个拷贝存在.应用RT PCR 和Northern 杂交结果证实,该基因在心皮和雄蕊中特异表达.关键词 BAG ,苦瓜,MADS 盒,性别决定,花中图分类号 S652 9;Q78YANG Manye;ZHAO Maojun;XU Ying;TANG Lin;B AI Jie;CHEN Fang.C loning and expression of a MADS box gene from bitter melon (Momordica charantia L .).Journal o f Bei j ing Forestry University (2004)26(4)3034[Ch,21ref.]College of Life Science,Sichuan University,610064,P.R.China.The flo wer specific gene of bitter melon,named BAG (GeneBank accession number AY 178837),is cloned by the method of 3!RAC E and 5!RACE using degenerate primer designed acc ording to the MADS boxprotein family conserved region from flower bud.A full length cDNA of 1001bp contains a c omple ted open reading fra me of 228amino acids,5!and 3!nontranslated regions and a long ploy (A)tail.The predicted a mino acids sequence of BAG show 95%sequence identity to MADS box protein CUM10(Cucumis sativus ),93%to C AG1(Cucumis sativus ),84%to MADS box protein GHMADS 2(Gossipier hirsutum ),72%to MADS box protein AGL11(Arabido p sis thaliana ),respectively.A comparison between the putative translation product of B AG and the other MADS box related proteins demonstrates that the highest conservation domain is found within the putative MADS box DNA binding domain.A second domain,the K box involved in dimerization,which is conserved a mong the MADS box proteins,is also found.Genomic Southern blotting analysis suggests the e xistence of at least two or three copies of the gene.Northern blotting and reverse transcriptase polymerase chain reaction indicates that the B AG cDNA is carpels and sta mens specific in bitter melon.Key words B AG ,bitter melon,MADS box gene,sex determination,flower 近年来,植物花发育分子机制的研究已成为植物分子生物学的热点领域,取得了令人瞩目的进展.随着对拟南芥,金鱼草等材料的研究,克隆了不少参与花序分生组织诱导,花分生组织转变和花器官形成调控[1]的同源异形基因,其中大部分属于MADS box 基因,它们编码的转录因子调控不同基因的表达[24],并由此建立了ABC 模型[5-7],初步揭开了植物花发育的奥秘.ABC 模型中的MADS box基因具有高度保守的MADS box 结构域和半保守的能形成卷曲螺旋的K 区.随着对MADS box 基因家族的研究,在越来越多的植物中克隆了MADS box 基因.研究表明,在整个被子植物中,MADS box 基因的功能是保守的,大部分都参与花发育的调控[8].苦瓜是一种重要的蔬菜作物,更是一种颇具开发潜力的药物资源.已分离纯化出苦瓜凝集素(MCL),苦瓜抑制剂(MCI),能抑制肿瘤细胞的 苦瓜素( Momorcharin)、 苦瓜素( Momorcharin)[9],具有抗艾滋病活性的MAP30 (Momordica anti Hiv protein)[10,11],以及核糖体失活蛋白(RIP)[12]等多种苦瓜种仁蛋白.近年来,从鲜苦瓜汁中,又提纯出一些新的化学成分,如苦瓜素甙、胡萝卜甾醇和抗生育活性成分.对于以果实为收获对象的植物,它们的性别表现与产品器官的成熟早晚、产量及品质密切相关.因此,研究直接参与花发育的MADS盒基因结构、功能及表达特性有助于从根本上阐明性别分化的机理,进行性别分化的定向调控,特别是促雌调控.1 材料和方法1 1 材 料苦瓜(Momordica charantia)品种为 大白苦瓜.材料采自四川大学生命科学学院药用植物种植园.大肠杆菌(Escherichia coli)菌株J M109 质粒载体: pMD18 T Vector,衍生自pUC18,用于PCR产物的T A克隆{从宝生物工程(大连)有限公司[TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.]购得}.1 2 苦瓜花蕾总RNA抽提、mRNA纯化、cDNA合成总RNA的抽提采用植物叶RNA(小量)抽提试剂盒(上海华舜).mRNA纯化采用Oligotex Direct mRNA Mini Kit(Qiagen).cDNA合成:按RACE方法将mRNA逆转录成cDNA[13].1 3 3!端cDNA片段的获得利用引物P1和P2:5! GATC AAG(A C)G(G C) ATCGAGAA 3!(根据MADS box保守区设计的简并性引物)从上述所得cDNA库中进行PCR扩增.PCR 采用两步策略[14]:线性扩增和指数扩增.线形扩增: 50L反应体系含5L10∀EX Taq Buffer(Mg2+ Free),2L dNTP(each2 5mmol L),4L MgCl2(25 mmol L),0 5L P2(20pmol L),1L cDNA,0 25L EX Taq(5U L),37 25L ddH2O.反应条件:95#5 min,(94#30s,54#100s,72#2min)30个循环; 72#10min.保持在65#.指数扩增:50L反应体系含5L10∀EX Taq Buffer(Mg++Free),6L d NTP (each2 5mmol L),4L MgCl2(25mmol L),2L P2 (20pmol L),2L P1(20pmol L),0 5L EX Taq (5U L),30 5L ddH2O.反应液预热到65#,同线性扩增反应液混合并开始下面的反应.94#30s,54# 100s,72#2min,30个循环.72#10min.1%琼脂糖凝胶电泳检测.回收预计1kb左右的条带、克隆到pMD18 T Vector,送上海基康生物技术公司测序.1 4 5!RAC E获得全长cDNA采用SMART TM RAC E cDNA Amplification Kit User Manual(C LONTEC H)将mRNA反转录成cDNA,由UPM(Universal Primer Mix,试剂盒提供)和GSP1 (Gene Specific Primer,根据已知序列设计,5! ATT C AT AGA GGC GAC C AC GGC TG 3!)进行第1轮PCR.反应产物稀释后作模板,用NUP(Nested Universal Primer)和GSP2(5! TC ACC TGCCGATTTGT CGTGTTC TC 3!)作引物,进行第2轮巢式PCR.反应条件:94#5s,72#3min,5个循环;94#5s, 70#10s,72#3min,5个循环;94#5s,68#10s, 72#3min,20个循环.PC R产物克隆、测序.1 5 Southern杂交DNA的提取按Dellaporta[15]方法略有改进.电泳、转膜按Clark(1997)[16]的方法进行.用该基因开放阅读框MADS box盒缺失区PCR产物作为探针,标记探针、预杂交、杂交、洗膜、免疫学检测等按DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II用户手册进行.1 6 Northern杂交总RNA提取按Clark(1997)[16]的盐酸胍法进行.电泳按Sa mbrook(1989)[17]手册进行.转膜、探针的制备、预杂交、杂交、洗膜、免疫检测同Southern杂交.1 7 R T PCR根、茎、叶、雄蕊、心皮、萼片、花瓣总RNA的提取按植物叶RNA(大量)抽提试剂盒(上海华舜)用户指南进行.cDNA的合成按Reverse Transcriptase X L(AMV)操作方法进行(Ta KaRa).用引物P MADS1(5! TAAAGAGGGTGGAAGATGGGGAG 3!),P MADS2(5! GAC CTCC AAAAGTAGC TGCCAAC A 3!)分别从根、茎、叶、雄蕊、心皮、萼片、花瓣的cDNA库中进行PCR扩增.反应体系为:1L模板,LA Taq TM(5U L)0 5L,10∀缓冲液5L,MgCl2(25mmol L)4 L,dNTPs(2 5mmol L)4L,特异引物P MA DS1、P MADS2各1L,无菌水33 5L,总体积50L.混匀后在PE Gene Amp Systems2400热循环仪上进行:94#3min; 94#30s,60#2min,72#3min,30个循环;72#7 min.产物上琼脂糖胶电泳.转膜、杂交(参见Southern 杂交).所用探针与Southern杂交探针相同.2 结果与讨论2 1 全序列分析为证实已获得的序列为苦瓜开花相关基因的cDNA全长片段,并为以后的表达提供基因来源,我们采用一步RT PCR法扩增了全长cDNA序列(见31第4期杨满业等:苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究图1).所用引物为:FL1:(同P1),FL2:5!ACGCGGGGGATC TGGTGGTG G3!(依据5! RAC E 末端片段序列设计的引物).序列分析表明,该片段全长1001bp,包含一个完整的ORF (Open Reading Frame)开放读码框,编码228个氨基酸.5!端和3!端非翻译区分别为50、267个碱基,poly(A)尾巴长22个核苷酸,具有典型的植物MADS box 基因的结构.将此片段命名为B AG 并提交GenBank,登录号为AY178837.图1 苦瓜MADS box 基因(BAG)cD NA 全长序列及其编码的氨基酸序列,示MADS box 和K box FIGURE 1 Nucleotide and deduced amino acid s equences encoding BAG,s howing the conserved MAD S boxDNA bindi ng domain (s hade)and putati ve K box (underline).2 2 氨基酸序列的同源性分析将推测的氨基酸序列在NCBI 上进行Blaxt X 搜索,发现它含有完整的MADS box 和K box 并与多种植物的MADS box 蛋白具有很高的同源性,与黄瓜(Cucumis sativus )C UM10[18],C AG1[19],棉花(Gossipierhirsutum )G HMADS2(Zheng et al .,2002,accession AF538966 1unpublished),(Vitas vini f era )[20],(Malusdomestica )[21],拟南芥(Arabidopsis thaliana )AGL11(Townetal .,2002,accessionNM117064 1unpublished)的同源性分别为95%、93%、84%、83%、76%、72%.比较结果列于图2.可以看出有几个主要区域的氨基酸序列的保守性较高,MADS box (1~60),K box (88~193).MADS box 大都紧靠在蛋白N 端第1个氨基酸之后,参与DNA 结合和二聚体形成,其中NRQVT 与VLCDA 序列是可能的DNA 结合位点.K box 的特点是一级序列趋异,二级结构保守,该区与角蛋白(Keratin)的一段氨基酸序列同源能形成亲水性的 卷曲螺旋,可能介导蛋白 蛋白间相互作用,促进二聚体化[4].2 3 苦瓜BAG 基因的拷贝数分析分别用限制性内切酶Bam H ∃,EcoR ∃,EcoR %,Hind &将基因组DNA 酶切消化,在1 0%琼脂糖凝胶上20~25V 电压电泳过夜.将酶切消化完全的基因组DNA 转移到尼龙膜上,以地高辛标记的MADS box 盒缺失区PCR 产物作为探针,在37~42#杂交4h 或过夜.杂交后的滤膜,按DIG High Prime DNA Labeling and Detec tion Starter Kit II 用户手册说明,进行洗膜、免疫学检测(见图3).根据图中限制性内切酶消化后,杂交条带的数目和分布可以看出,苦瓜BAG 基因在基因组中有2或3个拷贝,32北 京 林 业 大 学 学 报第26卷图2 苦瓜BAG基因推导的氨基酸序列与其他植物MADS box基因的比较FIG UR E2 Compari son of the bitter melon!s BAG gene a mino acid sequence(first line)with other pl ant M AD S box genes.Showing the different amino acids wi th letters.属于低拷贝数的基因.2 4 苦瓜B AG基因的表达分析苦瓜B AG基因的Northern杂交.将每道多达15 g的总RNA,按Sambrook方法电泳、转膜.杂交结果见图4.结果表明,苦瓜BAG基因在花的雄蕊(FF)、心皮(MF)有大量的转录产物存在,Northern杂交信号强烈,在其他的组织、器官中没有明显的杂交信号.其中又以心皮中苦瓜B AG基因的表达量最为丰富.RT PCR检测结果与此一致(见图5).这与黄瓜中控制花发育的MADS box基因CUM1,C UM10具有相同的表达模式.C UM1,C UM10与来自金鱼草(Antirrhinum)的AG基因具有很高的同源性,属于 C功能基因,严格限制在黄瓜第3轮雄蕊(雄花)、第4轮心皮(雌花)中表达,且心皮中的表达量比雄蕊更为丰富,它们在矮牵牛花(Petunia)中的异位表达使萼片变成了心皮,花瓣变成了雄蕊[18].研究发33第4期杨满业等:苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究现,基因的功能和表达形式与结构密切相关,由此可以推测苦瓜B AG基因属于 C功能基因,其表达与否直接决定着苦瓜雄蕊、心皮的发育,并最终影响着苦瓜的性别分化.图3 BAG基因的Southern杂交FIGURE3 Southern blotting anal ysis of BAGgeneA:分别自根(R)、茎(S)、叶(L)、雄蕊(FF)、心皮(MF)、萼片(SE)、花瓣(PE)提取的总RNA,每泳道总R NA上样量15g B:Northern杂交斑点图4 苦瓜BAG基因的Northern杂交分析FIG URE4Northern blotting anal ysis of BAG gene transcriptsin various bitter melon tis sues andorgans图5 苦瓜BAG基因表达的R T PCR检测FIGURE5 R T PCR detecti on of BAG expres sion参考文献1 Weigel D,M e yerowits E M.The ABCs of floral homeotic genes.Cell,1994,78:203 2092 Schwarz S,Huijser P,Nacken W,e t al.Genetic control of flowerdevel opment:Homeotic genes i n Antir rhinummajus.Science,1990,250:931 9363 Shore P,Sharrocks A D.The MAD S box fa mily of transcripti on factors.Eur J Bio Che m,1995,229:1 134 M a H,Yanofsky M F,Meyerowitz E M.AGL1~AGL6,anArabi dopsis gene family w i th si milari ty of floral homeotic andtrans cription fac tor genes.Genes Dev,1991,5:484 4955 Bowman J L,Smith D R,M eyero w i tz E M.Genetic interaction amongfloral homeotic genes of Arabidopsis thaliana.De velo 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