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一、单选1、第一个实现DNA重组的实验：1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。
2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。
3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。
4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。
5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA （噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA利叶绿体DNA,有的以线型存在，有的以环状存在。
6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNAo7、DNA的分离抽提法：酚■氯仿抽提法（常用、经典）。
8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。
9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。
10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。
口、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的OD260/OD280值应为1.7-2.0, OD260/OD230值应大于2.0,如果OD260/OD280小于1.7,可能有蛋白质污染，如果OD260/OD280大于2.0或OD260/OD23O小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。
12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
基因工程屮最常用的工具酶14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指II类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。
例如：Bacillus amylolique faciens H、Haemophilus influenzae d BamH> Hind I o“属种株序”15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制一修饰系统。
16、限制性内切核酸酶的作用机制识别双链DNA中特定的核昔酸17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
基因工程复习资料（已修改）基因工程复习资料一、基因工程：概念：基因工程是指采用类似于工程设计的方法，根据人们事先设计的蓝图，人为地在体外将外源目的基因插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合即重组载体DNA分子，并将这种含有目的基因的重组载体分子转移到原先没有这类目的基因的受体细胞中去扩增和表达，从而使受体或受体细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。
基本流程：（1）目的基因的分离、获取与制备（2）目的基因与载体连接构建成为重组载体分子（3）重组DNA分子导入到受体细胞（4）外源目的基因阳性克隆的鉴定和筛选（5）外源目的基因的表达二、基因工程的发展简史1、基因工程诞生的背景：（1）发现了生物的遗传物质DNA而不是蛋白质。
（2）明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。
（3）遗传密码子的破译。
2、技术上的三大发明：（1）利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA 片段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条道路。
3、基因工程的诞生标志（P4）三、工具酶1、限制性核酸内切酶常见的类型：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HindⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SamⅠ。
2、DNA连接酶常用的类型：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
3、DNA聚合酶类4、碱性磷酸酶5、末端脱氧核苷酸转移酶6、其他工具酶四、限制性核酸内切酶依来源分类1、同位酶：即识别相同的序列但切割位点不一样。
2、同尾酶：即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。
3、同裂酶：即识别位点和切割位点均相同的酶。
五、影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件1、温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37°C，但也有例外，如SamⅠ的反应温度为25°C.降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。
2、盐离子浓度：不同的限制性核酸内切酶对盐离子强度有不同的要求，一般按离子浓度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。
思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
常用的工具酶硝基序列内部进庁切割DrU逵接癖DT⅛A 1 i HaSe将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通⅛u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ⅛<⅛■补双链小心子上的单俺毅口，WP5* *^,D∖AΛ⅛-βfc i⅛÷ΦfX⅛.Γ*5⅛5*-3*外切a⅞渚性¾κ⅛⅛⅛e一J t'碳6⅛z⅛w子初»1多棱甘IHU⅛的I)NA Polynlerase k i πc∣isc F-DH半螭上r,<3ve rs e t. ran sc ri IH rise咲R∖A或DMt¾Λ⅛樓核合总互⅜b⅛∣DNA f⅛I)MAJK 却fr 移B⅜DhlA terminal DeOXyrLUC ICatidy transferase 44^LM4⅛⅛ 巴加到了进性双K或*ι⅛DNΛ⅛ 子⅛⅛3'- Oll 卓娴减IΛA⅛⅛Y-来姗减性辑酸酶BΛP Or ClP 核酸外⅛^b⅛III CXOnUCICaSe TrTF⅜j⅛⅞ħ⅛Slnucl p^ιse S I核酸酶RHl 31IiuulcastJ Ikil.31Taq DNA M⅛i⅛Iaq DNA p∩IynlCrrLSC核摘核瞋隔Rλcise脱氧4⅛4⅛⅛⅛aifi⅛DvISe去除［Γ⅛ KK九dNTF j⅛⅛5,⅞⅛ι⅛^≡lF^MIΛA3,-0HX⅛⅛的孩昔酸⅛也移解单链加A或R∖A,产生带亍璘酸的单械甘酸或專聚才茫昔百罠，祠时电可切害J J空t⅛棱酸分子的单1⅛ 护琳双ι⅛l)∖A, RKΛ⅛⅛5f及3'末端.高专—性单健核昔酸能在高温(72C ) -F⅛⅛⅛MDλA>⅛⅛板.从3'方向令咸新生的互补谜专一懺降解RMA内切械肢晦.4⅛M4tl⅛或双1⅛DNA2•说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)ECORl属毛种类 株系 编号3. 限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性。
复习题1 （包括分子生物学基础知识）（请各位同学将所有题目翻译成英文后再做!）一、解释下列名词1.Gene manipulation2.Promotor3.Cloning:4.Subcloning二、填空题：将下列各题空缺部分的答案填在后面的方框内，两者用“；”隔开。
1.基因操作（Gene manipulation）的核心部分是基因克隆（gene cloning）, gene cloning的基本要点有（），（）和（）。
2.（）是遗传物质的基木单位，也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。
它可以是连续的，也可以是（）；可以是（），也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以（）3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（）、（）、（）和（）等与基因研究相关的内容。
4.启动子（Promo（or）是指（）。
通常一个Gene是否表达，（）是关键的一步，是起决定作用的。
在转录过程屮，Promoter还是（）的结合位点。
5.原核生物的RNApolymerase主要由两部分组成：（）和（），其屮。
■因子并不参与RNA 的合成，它的作用主要是（）。
6.从（）到（）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其屮可包括一个或者多个Gene。
7.转录终止子主要有两种，一种是（），另一种是（）。
8.重叠基因（Overlapping gene）是指（）,间隔基因（Interrupted gene）是指（）三、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。
四、简答题：1.简述基因克隆的两个基本特征？参考答案：基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主屮的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。
2.什么是gene cloning ?什么是亚克隆（subcloning） ?参考答案：基因克降：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切，消化等步骤，分离带有目的基因的DNA片段。
一、基因工程的三大关键要素（元件）基因：目的基因（Vs用途,interesting/targetgene）、外源基因（Vs宿主,foreigngene）载体：能将外源基因带入受体细胞，并能维持的DNA分子。
受体：宿主，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）二、基因工程的基本过程依据定义，基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成，基本过程如下：(1)从供体细胞分离出基因组dna。
用限制性核酸内切酶分别将外源dNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)：(2)用dna连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成dna重组分子(简称“接”)。
(3)借助细胞转化手段将DNA重组分子导人受体细胞中(简称转”)。
(4)短时间培养转化细胞．以扩增dna重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增”)。
（5）筛选和鉴定经转化处理的细胞。
获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）由此此可见．基因工程的上游操作过程可简化为；切、接、转、增、检：三、质粒载体pBR322系列有哪些特征？BR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：第一，具有较小的分子量。
pBR322质粒DNA分子为4363bp。
第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
pBR322DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA的插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15），可以有效的检测重组体质粒。
第三，具较高的拷贝数，通常有大约15个左右的拷贝，在氯霉素存在下，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
这就为重组DNA的制备提供了极大的方便四、M13系列载体具有哪些优缺点?答：M13克隆系统具有很多优点：(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。
有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6～7倍的DNA(插入片段可达40kb)。
第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（ gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程（ gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA 元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。
基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。
第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。
从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。
基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是 DNA 也可以是RNA ，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。
基因工程的理论基础：⑴ . 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA ，明确了遗传的物质基础。
⑵. DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。
⑶ . 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。
(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。
自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：DNA 重组⑴ . DNA 体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA 连接酶的发现与应用，标志着时代的开始）。
⑵ . 克隆载体的发展与应用。
⑶ . 大肠杆菌转化体系的建立。
⑷ . 琼脂糖电泳技术的应用。
⑸ . DNA 测序技术的应用。
分子克隆技术期末考试一、名词解释I > Restr i ct i on Endonuc I ease （限制性内切酶）:是一类识别双链DNA分子中的某种特定的核昔酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA的核酸内切酶。
2、Competent ceI I （感受态细胞）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态，即易于吸收外源DNA的细胞。
3、Star activity （星星活性）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
4、Plasmid （质粒）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，其大小通常在1-100KB范围内。
5、Plasmid vector （质粒载体）：在由限制性内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导入宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。
6、Binary vector （双元载体）：既有犬肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。
7、shuttle vector （穿梭载体）：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。
这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列（ARS）以及选择标记性状，具有多克隆位点。
8、I socaudarner （同尾酶）：不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端。
同尾酶切割DNA得到的产物可以进行互补连接。
但形成的新位点不能被原来的酶识别。
9、MCS （multiple cloning site,多克隆位点）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，它是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。
10、S igna I peptide （信号肽）：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质定位的N 端的氨基酸序列（有时不一定在N端）II > R/M system （restr ict ion and modif icat ion system,限制与修饰系统）：限制酶和甲基转移酶（甲基化酶）组成限制和修饰系统。
基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA 重组技术。
基因工程的别名基因拼接技术或DNA 重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA 分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达实质（原理）基因重组克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特性结果改造的方向二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”2、 DNA 连接酶 ----- “分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体----- “分子运输车”1 ．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（ 1 ）存在：主要存在于原核生物中。
（ 2 ）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
（ 3 ）切割部位：磷酸二酯键（ 4 ）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（ 5）识别序列的特点：（ 6 ）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针” —— DNA 连接酶（ 1）作用：将限制酶切割下来的DNA 片段拼接成 DNA 分子。
（ 2）类型种类 E · coliDNA 连接酶T 4DNA 连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体只能将双链 DNA 片段互补缝合两种末端，但功能的黏性末端之间的磷酸二连接平末端之间的特性酯键连接起来效率较低相同点：都连接磷酸二酯键3．“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
专题1基因工程章末复习知识体系构建专题整合一、基因工程的基本工具【训练1】下列有关基因工程技术的正确叙述是()A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体B.为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞0.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达二、基因工程的操作程序1.目的基因的获取(1)目的基因：指编码蛋白质的结构基因。
(2)获取方法：从基因文库获取，原核基因也可直接分离获得；真核基因主要是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞屮稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：启动子+目的基因+标记基因+终止子。
①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录tBmRXA,最终获得所需要的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：鉴定受体细胞屮是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选岀来。
常用的标记基因是抗生素抗性基因。
【训练2】正确表示基因操作“四步曲”的是（）A.提取目的基因一目的基因导入受体细胞”目的基因与载体结合”目的基因的检测与鉴定B.目的基因的检测与鉴定一提取目的基因一目的基因与载体结合一目的基因导入受体细胞0.提取目的基因一目的基因与载体结合一目的基因导入受体细胞一目的基因的检测与鉴左D.目的基因与载体结合一提取目的基因一目的基因导入受体细胞一目的基因的检测与 鉴定三、蛋白质工程 1. 蛋白质工程流程中心法则2. 蛋白质工程与基因工程的区别：蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界 不存在的蛋白质，所以被形象地称为笫二代基因工程；基因工程在原则上只能生产自然界已 存在的蛋白质。
【训练3】利用蛋白质工程改造天然蛋白质，进而改变其功能，可获得毒副作用减小，专 一性、药效和稳定性都增强的理想的药物。
1、生物技术：（biotechnology),是指人们以现代生命科学为基础,结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的2、生物技术的核心：生物技术是现代生物学发展及其与相关学科交差融和的产物，其核心是以DNA重组技术为中心的基因工程，还包括微生物工程、生化工程、细胞工程及生物制品等领域3、基因工程：（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术,在体外把核酸分子插入载体分子，构成重组DNA,引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系）.2。
基因工程概念的发展:遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆(Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973:Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978:Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1982:世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市 1988:PCR技术诞生1989:我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003：世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因(供体）:外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子。
宿主（受体）：,能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体)。
5、基因工程的目的：产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。
6、基因工程的特征：1)跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。
2）无性扩增：外源DNA在宿主细胞内可大量扩增和高水平表达。
7、基因工程研究的理论依据:①不同基因具有相同的遗传物质基础。
②基因是可以切割的。
③基因是可以转移的。
④多肽与基因之间存在着对应关系。
⑤遗传密码是通用的。
第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
步骤：1）溶菌：溶液I （50mM 葡萄糖,25mMTris-HCI, 10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶）2）破膜：溶液II （0.2N NaOH 1.0%SDS）3）中和：溶液III （3M醋酸钠pH4.8）4）离心5）转移：将上清转移到一个新的离心管中6）抽提：酚•氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇一25/24/17）沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸钱辅助沉淀）基因组DNA的提取纯化方法（1）细菌基因组DNA的制备细胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。
SDS是阴离子型去垢剂（detergent）,可以使细胞膜崩解。
）-＞DNA纯化（CTAB（十六烷基三甲基漠化鞍）除去多糖，酚■氯仿■异戊醇除去蛋白。
）一〉沉淀DNA （0.6倍体枳的异丙醇或2倍乙醇（可以加入V10体枳的3M醋酸氨辅助沉淀））（2）哺乳动物细胞基因组DNA的抽提组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。
）一〉细胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。
50°C温育。
）一＞沉淀DNA （用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。
（加入V10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。
）（3）从植物组织小制备DNA组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。
）一＞细胞裂解（用2%CTAB/2-ME （十六烷基三甲基漠化鞍Q藐基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。
65 °C温育。
）一〉沉淀DNA （用0.6倍体积的异丙醇（-20°C）o （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀））2. DNA的定量和纯度测定方法（1）紫外光谱法：DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰，对于纯DNA： OD260/OD280=1.8,若低于1.8说明有蛋白质杂质（2）琼脂糖凝胶电泳估计澳化乙锭（EB）能插入DNA分子中。
与己知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。
3•琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下, 核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）o将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极一正极移动。
相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。
琼脂糖凝胶电泳的应用：用于対DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。
4•聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N】，N1- methylene bisacrylamide）®催化剂的作用下聚合而成。
引发剂：过硫酸鞍，加速剂：TEMEDo 电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。
电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
凝胶浓度越大，空隙越小。
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。
5•核酸杂交原理、类型及应用原理：核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的己知序列的单链核酸片段（DNA或RNA）作为探针，与未知的核酸片段进行杂交，形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNAo包括：DNA-DNA 杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。
特点：特异性高；灵敏度高；定位准确应用：基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测；基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生物病原体检测。
变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的盘键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
A260值达到最人值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm）,此时50%的DNA分子发生了变性。
Tm与核酸的G、C含量有关。
Tm= （G+C） % X 0.41+69.3Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。
复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。
在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30°C时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。
预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。
在杂前的这些处理过程称为预杂交类型：根据核酸的来源、种类和形式分为Southern blot, Northern blot,菌落原位杂交，斑点杂交，组织原位杂交Southern blot：DNA分子一〉限制性酶切为限制片段一〉琼脂糖凝胶电泳一＞NaOH变性一＞转膜固定一＞杂交一〉显影Northern blot：提取T＞ Cell总RNA一＞提纯分离mRNA—＞琼脂糖凝胶电泳分离RNA—＞转移至硝酸纤维素膜一＞杂交检测斑点杂交：其原理与步骤与Southern印迹杂交相似，所不同的是不进行核酸的酶解和电泳分离，直接将变性的DNA或RNA加到固相载体上。
菌落/噬菌斑原位杂交：直接将菌落（噬菌斑）原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。
溶菌（噬菌斑）变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落（噬菌斑）。
组织/细胞原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞、组织、染色体或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。
原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA 杂交。
基因芯片：基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。
6. PCR概念、PCR技术的基本原理及特点、引物设计要求及常见问题PCR概念：应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。
PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核葫酸引物。
PCR由变性••退火••延伸三个基本反应步骤构成。
变性：升高温度使模板DNA 变性、双链分开。
退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合。
延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3,轻基端开始，与模板DNA±的碱基配对逐个加上核昔酸，合成新的DNA链。
循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环屮又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍。
经过多次循环使DNA 含量显著提高。
特点：灵敏度高、特异性强、快速检测、定量准确、重复性好特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
引物设计要求：•引物长度（length） : 20〜30bp•G+C含量以40-60%为宜•两引物间不能有互补序列，尤其是才端•引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性•引物的3,末端碱基一定要与模板DNA配对•可以在5,末端加上限制性内切酶位点或起始密码•解链温度（Tm）：两引物间相差不大于5°C・引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在•ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘿吟或喀喘核背酸的成串排列常见问题：（1）假阴性原因：模板质量不好；酶失活；引物特异性差或质量问题；Mg2+浓度过高对策：重新進备模板；更换酶并避免反复冻融；重新设计引物并分装；降低Mg2+浓度（2）假阳性原因：引物设计不合适；靶序列或扩增产物的交叉污染对策：重新设计引物；改进操作，避免污染（3）出现非特异性扩增带原因：是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体；是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关；酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增对策：重新设计引物，降低引物暈；适当提高退火温度，减少循环次数:减低酶量或调换另一来源的酶（4）出现偏状拖带或涂抹带原因：酶量过多或酶的质量差；dNTP浓度过高；Mg2+浓度过高；退火温度过低；循环次数过多引起对策：减少酶量，或换另一种酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；提高退火温度; 减少循环次数。
