黑曲霉原生质体形成与再生影响因子的研究

安徽农业大学学报,2003,30(3):333～336Jou rnal of A nhu i A gricu ltu ral U n iversity黑曲霉原生质体形成与再生影响因子的研究①李　平1,张　强1,宛晓春1,陶文沂2,丁霄霖2(11安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室,合肥230036;21江南大学)摘　要:运用正交试验设计研究酶系统、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素对黑曲霉原生质体形成与再生的影响,确定黑曲霉原生质体形成与再生的最佳条件,获得高产原生质体,其浓度可达310×106个 mL,再生率达25%以上。

并于欧林巴斯相差显微镜下观察了黑曲霉原生质体的形成过程。

关键词:黑曲霉;原生质体形成与再生;正交设计 中图分类号:T S20113文献标识码:A文章编号:100022197(2003)03203332041978年原生质体融合作为一种新的基因重组手段于第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出, 1979年Chang和Cohen首次报道了枯草杆菌种内的原生质体质粒DNA高频转化,随后原生质体技术被广泛应用于各种研究之中,如原生质体诱变,原生质体的线粒体、病毒、外源DNA等的引入,原生质体固定化等[1～3]。

本试验采用原生质体技术对菌株进行改良[4],根据正交试验法[5]对黑曲霉原生质体形成与再生的影响因子进行探讨,以提高菌株的产酶性能。

首先对出发菌株黑曲霉进行酶解,获得大量的原生质体,然后让其再生,再经条件优化确定出原生质体形成与再生的最佳条件,同时,在相差显微镜下观察了黑曲霉原生质体的形成过程。

1　材料和方法111　材料菌种:黑曲霉(A sp erg illus n ig er),江南大学(原无锡轻工大学)赠送。

培养基:PDA斜面培养基,菌丝生长培养基(G M)和原生质体再生菌丝培养基(RM)[5]。

试剂:纤维素酶、蜗牛酶由北京经科化学试剂公司生产,溶菌酶由广东微生物研究所生产。

仪器:OL Y M PU S相差显微镜。

112　方法菌丝培养:取斜面上生长成熟的孢子,用无菌水制成孢子悬液,并调整孢子浓度至4×106 mL以上,取013～015mL接种于表面覆盖有玻璃纸的G M固体培养基上,于30℃培养16～18h。

原生质体的分离:用灭菌镊子轻轻揭下长有幼菌丝的玻璃纸,于酶液中保温2～3h,然后用高渗磷酸缓冲液(pH515)稀释,过G2漏斗,2000r m in离心洗涤数次,收集原生质体并计数。

原生质体再生:取纯化后的原生质体悬液稀释适度后,涂布于高渗和低渗再生培养基平板上,30℃培养2～3d,观察菌落数,计算再生率。

原生质体形成与再生形态观察:在原生质体形成过程中,每隔一段时间定时观察,并作固体培养,观察原生质体再生情况。

2　结果与分析211　原生质体形成的最佳条件选用16h菌龄之菌丝体作为试验对象,以混合酶(纤维素酶+蜗牛酶+溶菌酶)、KC l稳定剂、酶解①收稿日期:2003201216作者简介:李平(1968-),女,博士研究生,副教授。

时间、酶解温度为考察因素,正交设计见表1,试验结果如图1所示。

表1　正交试验L9(34)的因素水平T ab le1　Facto rs of o rthogonal test L9(34)序号N o1酶系统(A)Enzym e system酶解温度(B) ℃T emperatu re稳定剂(C) mo l・L-1Stab ilizer酶解时间(D) hT i m e10125%纤维素酶Cellu lase+015%蜗牛酶Snail enzym e+0125%溶菌酶L ysozym e2501621020125%纤维素酶Cellu lase+0125%蜗牛酶Snail enzym e+015%溶菌酶L ysozym e300182153015%纤维素酶Cellu lase+0125%蜗牛酶Snail enzym e+0125%溶菌酶L ysozym e35014310表2　方差分析T ab le2　T he analysis of variance变异来源V arial sou rce D F SS M S F F0105F0101区组间Group201410120313731636123 A267167331845621293331636123 B261643132551153331636123 C251242162431573331636123 D234133171172851283331636123误差E rro r1601960160总变异To tal variati on26115126 表2方差分析表明,A、B、C、D均是影响原生质体形成的极显著因素。

由图1可知,原生质体制备最佳条件为:在30℃条件下,以016m o l L KC l为稳定剂,经混合酶(015%纤维素酶+0125%蜗牛酶+ 0125%溶菌酶)作用215h后,原生质体产量可达3122×106个 mL,并经多次试验最终稳定在310×106个 mL以上。

212　原生质体再生的最佳条件原生质体的再生常受原生质体制备条件、再生培养基成份、培养条件等因素影响。

经L16(44×21)正交试验(见表3)的方差分析(表4)表明,酶系统、酶解时间、酶解温度是影响原生质体再生的极显著因素,而试验范围内的培养基pH、培养温度为非显著因素。

由图2可知,在最佳条件下制备的原生质体,当培养基pH为510～515时,30℃条件下,结合培养基碳源,再生稳定剂的优选,以淀粉为碳源,KC l 为再生稳定剂,经多次试验可以获得原生质体再生率为25%以上。

表3　正交试验L16(44×21)的因素水平T ab le3　Facto rs of o rthogonal test L16(44×21)序号N o1酶系统(A′)Enzym e system酶解温度(B′) ℃T emperatu re酶解时间(C′) hT i m e培养温度(D′) ℃Cu ltu re temperatu re培养基pH(E′)M edium pH10125%纤维素酶Cellu lase+0125%蜗牛酶Snail enzym e+0125%溶菌酶L ysozym e20310285152015%纤维素酶Cellu lase+0125%蜗牛酶Snail enzym e+0125%溶菌酶L ysozym e253152551030125%纤维素酶Cellu lase+0125%蜗牛酶Snail enzym e+015%溶菌酶L ysozym e30210324015%纤维素酶Cellu lase+015%蜗牛酶Snail enzym e+015%溶菌酶L ysozym e3521530433安徽农业大学学报2003年表4　方差分析T ab le 4　T he analysis of variance变异来源V arial sou rceD F SS M S F F 0105F 0101区组间Group211980199<121904146A ′31236115412105　3511613321904146B ′310216134120　291193321904146C ′310417934193　291813321904146D ′371412147 2111　41157150E ′101030103<1误差E rro r32371501117总变异To tal variati on471490147A 1酶Enzym e ;B 1温度T emperatu re ;C 1稳定剂Stab ilizer ;D 1时间T i m e图1　L 9(34)正交试验结果F igu re 1　R esu lt of L 9(34)o rthogonal experi m en tA ′1酶系统Enzym e system ;B ′1酶解温度T emperatu re ;C ′1时间T i m e ;D ′1培养温度Cu ltu re temperatu re 图2　L 16(44×21)正交试验结果F igu re 2　R esu lt of L 16(44×21)o rthogonal experi m en t1、2、3分别是对照和酶解110h 、215h 后的原生质体(1放大40×6倍,2、3放大60×6倍)1:CK ,40×6ti m es ;2,3:the p ro top lasts of lysis fo r 110h ,215h ,respectively ,60×6ti m es图3　黑曲霉原生质体形成过程F igu re 3　P rocess of p ro top last fo rm ati on of A sp .n ig er213　原生质体形成与再生的形态观察供试菌体的细胞壁经混合酶液约110h 的水解作用后,可见菌丝的顶端或其它部位出现细胞膜外凸,然后逐渐膨大形成小球体,随着体积的不断增大,约210h 时,有小球脱离菌丝成为原生质体;215h 后,可见大量原生质体形成(见图3)。

该原生质体在固体培养基(RM )中再生与对照平板(G M )相比,生长速度较慢,原因可能是破壁后的细胞,再生时要有个生理适应过程,故生长速度要滞后于正常细胞。

综上所述,在黑曲霉原生质体的制备和再生的过程中,应该注意以下几点:(1)根据黑曲霉细胞壁组成的固有特点,在制备黑曲霉原生质体时应选用混合酶为酶解系统,同时充分考虑酶作用时的温度敏感性、最佳作用时间和离子环境。

(2)在黑曲霉原生质体再生过程中,虽然在试验中采用的培养温度和培养基pH 对再生生长影响不大,即黑曲霉适合于这样的生长温度和pH 范围,但是,考虑到必需在原生质体制备的最佳条件下进行原生质体再生,所以,最终需达到较高的原生质体再生率和最佳的原生质体制备条件的统一。

(3)对原生质体形成进行观察时,发现酶解215h 后,原生质体数量随酶解时间的延长有所增加,但考虑到对原生质体再生的影响,此时应立刻终止酶解反应。

53330卷3期 李　平等　黑曲霉原生质体形成与再生影响因子的研究633安徽农业大学学报2003年参考文献:[1]李平,宛晓春,陶文沂等1复合诱变黑曲霉选育Β2葡萄糖苷酶高产菌株[J]1菌物系统,2000,19(1):117～121[2]宛晓春,李平,陶文沂等1无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探讨[J]1应用生态学报,1998,4:440～442[3]栾军1试验设计的技术与方法[M]1上海:上海交通大学出版社,1987[4]A rtu s N ancy N,U em u ra M atsuo.O n stitu tive exp ressi on of the co ld2regu lated A R ab idop sis thaliana COR15a gene af2fects bo th ch lo rop last and p ro top last freezing to lerance[J]1P roceedings of the N ati onalA cadem y of Sciences of the U2 n ited States of Am erica,1996,93,23:13404～13409[5]Kum ari J A n jan i,Panda T.In tergeneric hyb ridizati on of trichoderm a reesei QM9414and saccharom yces cerevisiaeN C I M3288by p ro top last fu si on[J].Enzym e and M icrob ial T echno logy,1994,16(10):870～882[6]Y in k i ong Hoh.P ro top last fu si on ofΒ2gluco sidase2p roducing A sperillu s n iger Strain s[J].A pp lied B i ochem istry andB i o techno logy,1992,37:81～88Effects of the P ro top last Fo rm ati on andR egenerati on from A sp erg illus n ig erL I P ing1,ZHAN G Q iang1,W AN X iao2chun1,TAO W en2yi2,D I N G X iao2ling2(1.A nhu i A gricu ltu ral U n iversity,Key L abo rato ry of T ea B i o techno logy of M in istry of A gricu ltu re,H efei230036;2.Sou thern Yangtze U n iversity)Abstract:T he effects of enzym e system,reacti on ti m e and tem p eratu re,o s m o tic stab ilizer on p ro to2 p last fo rm ati on and regenerati on from A sp.n ig er w ere studied by o rthogonal test.T he op ti m al conditi on fo r p ro top last fo rm ati on and regenerati on of A sp.n ig er w as ob tained.T he concen trati on of p ro top last fo rm ati on w as up to310×106 mL and the p ro top last regenerati on rate w as over25%fo r the strain.T he p rocedu re of fo rm ati on of p ro top last fo r A sp.n ig er w as ob served under O lym p u s m icro scop e.Key words:A sp erg illus n ig er;p ro top last fo rm ati on and regenerati on;o rthogonal test。