植物组织培养的培养基配制

植物组织培养实验一：培养基的配制学院：风景园林院学号：131001226 姓名：张晟菓一、实验目的1. 掌握植物组织培养实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。

2. 掌握培养基的配置方法。

3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理鉴于微生物种类及代谢类型的多样性，用于培养微生物的培养基的种类也很多。

培养基的配置的程序有器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，以及培养基的无菌检查等。

此次配制400mL MS培养基。

三、实验材料1.药品：激素：BA 1.0L（200mg/L）NAA 0.2L（200mg/L）母液：MS1（大量元素）20mL——浓缩20倍MS2（微量元素）2mL——浓缩200倍MS3（铁盐）2mL——浓缩200倍；MS4（维生素和氨基酸）2mL——浓缩200倍琼脂：2.2g蔗糖：12g（3%）无菌水2.玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、玻璃棒、培养皿3.仪器设备：电子天平4.其他物品：药匙、滤纸、称量纸、pH计、记号笔、棉花等四、实验步骤1.玻璃器皿清洗：将试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水和蒸馏水冲净。

移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。

晾干后备用。

2.量取母液：MS1（20mL），MS2（2mL），MS3（2mL），MS4（2mL）；加激素：BA（1.0mL），NAA（0.2mL）；加蔗糖：12g。

3.加水定容至400mL。

4.搅匀后用pH计、烧碱溶液及硫酸溶液调pH值至5.8。

5.加琼脂2.2g，用电磁炉加热溶解并搅拌5-6分钟，冒泡即可拿出。

6.趁热分装，包扎，贴标签。

五、实验结果培养基配置完成。

培养基培养基是植物组织培养的重要基质。

在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。

因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。

一主要培养基配方:1．CC培养基(mg/L)2．NB培养基3．N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。

其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

4．MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。

特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。

其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。

它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。

有些培养基是由它演变而来的。

5．MSM培养基6.改良怀特培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。

1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。

其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。

二培养基的配置在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。

为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。

所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。

一般母液配成比所需浓度高10-100倍。

母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。

配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。

配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。

药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。

药品的称量及定容都要准确。

植物组织培养基母液的配制
植物组织培养基是培养植物细胞、组织和器官的基础培养介质。

配制
植物组织培养基的母液可以按照以下步骤进行：
1. 准备所需的化学品和试剂，包括无机盐、有机添加剂、维生素和其
他辅助物质。

这些化学品可以根据不同的植物种类和培养目的进行选择。

2. 称取所需的化学品，并依次加入无菌蒸馏水中。

搅拌溶解，直到所
有化学品完全溶解。

3. 调节pH值。

使用pH计测量溶液的pH值，如果需要，可以使用酸
或碱来调节pH值，直到达到所需的pH范围。

4. 向溶液中添加琼脂糖或琼脂糖替代物，作为凝胶剂。

溶解并搅拌直
到完全溶解。

5. 过滤溶液，以去除悬浮固体和杂质。

使用无菌滤纸或滤器进行过滤。

6. 灭菌。

将过滤后的溶液装入无菌烧瓶或容器中，使用高压灭菌器或
自动压力锅进行灭菌，通常在121℃高压下灭菌20-30分钟。

7. 灭菌后，将培养基倒入无菌培养瓶中，密封并保存在冰箱中或低温
环境中。

以上是植物组织培养基母液的配制步骤，具体的操作和配方可以根据
不同的要求和实验目的进行调整。

植物组培培养基及其配制培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。

因此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。

一、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。

1.无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。

磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。

钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。

而钙、钠、镁的需要则较少。

培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。

微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。

培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA(螯合剂)的混合。

2.碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。

因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。

培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。

蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。

3.维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。

培养基中的维生素属于B 族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。

4.有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。

最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。

另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。

5.生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。

如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

(2)细胞分裂素。

如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。

(3)赤霉素。

组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。

二、常用培养基配方及其特点1.常用培养基配方组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。

植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

组织培养的步骤一、培养基配制配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。

就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。

为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2·2H2O 44gMgSO4·7H2O 37g各自配成1L的母液。

倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025gZnSO4·7H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

★★★★★实验二植物组织培养培养基的配制与灭菌一、实验目的1.培养基能够提供植物生长、繁殖所必须的各类营养物质，以及生长因子，是开展植物组织培养研究的基础和前提。

植物的种类不同，研究的目的不同，所需要的培养基的种类也各不相同。

2.学习并掌握植物组织常用培养基的组成、配制与灭菌方法。

二、实验用具和药品1. 实验用具：电子天平（1/10、1/1000）、烧杯（100ml、1000ml）、量筒（50ml、100ml）三角瓶或培养瓶、移液管、药匙、玻棒、pH试纸、吸耳球、牛皮纸、皮筋等。

2. 药品：蔗糖、琼脂、0.1mol/L NaOH、 0.1mol/L HCl、各种培养基母液、激素母液三、实验内容与步骤（一）分组配制培养基。

各类培养基组成如下：1. 水琼培养基。

2. MS0培养基。

3. 1/2MS培养基。

4. MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L。

5. MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

6. MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。

7. MS+KT 0.5mg/L+6-BA0.5mg/L。

8. MS+NAA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L。

（二）湿热灭菌培养基1.称取规定数量的琼脂，加水到培养基最终容积的3/4，水浴或电炉使之加热溶解。

2.根据配方要求，把按顺序量取的各种母液以及称取的蔗糖，都加入煮好的琼脂中，然后加水定容。

3.用0.1mol/L的NaOH或者HCl调pH。

4.分装培养基，包好或盖好，标明编号。

5.121℃(103kPa)灭菌15-20min。

（三）作好植物组织培养的各项准备工作1. 制备无菌水：121℃(103kPa)灭菌40min 。

2. 配制 0.1%HgCl2溶液（放置棕色瓶中）。

3. 准备接种用培养皿、金属器械等用具。

四、注意事项1. 实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。

2. 用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放置在小烧杯中称量。

培养基的配制植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。

MS培养基的配制包括以下步骤。

培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ)KI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇20 000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O 分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

植物组织培养MS培养基配方（一）母液配制与保存配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。

为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。

母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。

基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍）1大量元素配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。

表1大量元素母液（配1L20倍的母液）2微量元素母液在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。

倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。

由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。

配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。

混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中4、有机物母液按表4中的量分别称取各种有机物，分别溶解后，用蒸馏水或去离子水定容于1000mL，放入细口瓶中备用，贴好标签于4℃冰箱中低温保存。