高中生物 专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离练习 新人教版选修1

- 1 - 课题3血红蛋白的提取和分离

蛋白质分离的原理和方法

[自读教材·夯基础]

1．蛋白质分离的理论依据

2．分离的方法

(1)凝胶色谱法：

①概念：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

②凝胶 形态：微小的多孔球体组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道

③原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。

(2)电泳：

①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

②原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③影响电泳速率的因素： 1．透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。

2．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。

3．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。

4．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。

5．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、 - 2 -

④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

[跟随名师·解疑难]

1．凝胶色谱法

(1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。

(2)原理：

项目 相对分子质量大 相对分子质量小

直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面 小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部

运动方式 垂直向下移动 无规则扩散进入凝胶颗粒

运动速度 较快 较慢

运动路程 较短 较长

洗脱次序 先从凝胶柱洗脱出来 后从凝胶柱洗脱出来

2．电泳的常用方法

(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①凝胶形成：

②加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[特别提醒] 测定蛋白质相对分子质量通常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直接测定。 - 3 - 实

验 操 作

[自读教材·夯基础]

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②过程：

(2)血红蛋白的释放：

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程：

(3)分离血红蛋白溶液混合液离心――→分离用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层―→分液漏斗中静置片刻―→分离出下层红色透明液体。

2．粗分离——透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。

(2)目的：将相对分子质量较小的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3．纯化

(1)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。

(2)过程： - 4 -

4．纯度鉴定

在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。

2．在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。

3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

[跟随名师·解疑难]

1．分离血红蛋白溶液的结果

2．样品处理、分离与纯化的目的不同

操作 目 的

红细胞洗涤 去除杂质，如血浆蛋白 - 5 - 血红蛋白释放

使红细胞破裂，释放血红蛋白

分离血红蛋白溶液 经过离心使血红蛋白与其他杂

质分离开透析的杂质 除去样品中相对分子质量较小

纯化 除去相对分子质量较大的蛋白质

3．实验结果分析与评价

(1)对血液样品处理后样品发生的变化：

①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

②红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。

(2)判断装填的凝胶色谱柱成功与否：

①方法 在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的 日光灯，检查凝胶是否装填均匀加入大分子的有色物质，观察色带 移动情况

②成功的标 准及调整 若色带均匀、狭窄、平整，说明性能 良好若色谱柱内出现纹路或是气泡，可 轻轻敲打柱体以消除气泡，若消 除不了则重新装柱

(3)对分离效果的判断：

①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

②若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

[特别提醒] 洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过滤后再加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。

凝胶电泳法原理分析

[例1] 右图表示对某蛋白质溶液进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果 - 6 - (相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述错误的是( )

A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动

B．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少

C．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质量的大小

D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种

[解析] 蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。

[答案]

B

归纳拓展

蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。

凝胶色谱法的原理与操作

[例2] 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是__________，原因是___________________________________________________。

(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________________________替代。

(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_____________________________________________________

____________________________________________________________。

(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________________________。

(5)若选用SephadexG­75，则“G”表示____________________________，75表示____________________________。

[解析] 本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，可按以下思路进行分析作答。

(1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。 - 7 - (2)注意事项：①凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。②凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。③装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。④样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。

[答案] (1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快 (2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定 (5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g

归纳拓展 凝胶色谱操作注意事项分析

(1)实验结果如果不理想，需要重做时，必须进行凝胶色谱柱的重新装填。一般情况下，凝胶不会与其他溶质发生任何作用，因此，在一次分离以后，稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时，需用3倍柱体积的洗脱液过柱。

(2)如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱，可以用物质的量浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5 mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。

(3)如果凝胶长期不用，可以加入抑菌剂低温保存，使用时再进行充分的平衡。

[随堂基础巩固]

1．在使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为(

)

解析：选B 蛋白质相对分子质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱出来 ，蛋白质相对分子质量越小越易进入凝胶内部而后被洗脱出来。

2．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，错误的是( )

A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂

B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

解析：选D 相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快。