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06+常用工具酶

06+常用工具酶
从普通大肠杆菌分离出来的质 粒DNA，由于甲基化，难酶切
可选择甲基化酶缺失的大肠 杆菌菌株制备质粒DNA
3.酶切消化反应的温度
大多数RE的最佳反应温度是37°C
实际操作中常采用水浴锅，但由于离心
管底部与顶部温度不同，反应体系会蒸 发，引起酶反应条件改变，可能会造成 酶产生星活力； 酶反应时间较短（2h左右)时可在水浴锅 内进行，如时间较长，最好在培养箱内 进行反应
酶切操作过程： 根据RE说明书，建立酶切反应体系
加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀 一定温度下保温一定时间 终止反应
电泳检测酶切结果
六、影响限制性酶切反应的因素
1. 2. 3. 4. 5. DNA样品纯度及分子结构 DNA甲基化程度 酶切反应温度 缓冲液 操作注意事项
1.DNA样品的纯度和分子结构：
如:Sam I(CCC GGG)和Xma I(C CCGGG)
同尾酶：不同RE识别不同序列,但切割后能 产生相同的粘性末端，可以连接起来; 如:Bcl I和BamH I

↓
↓
同尾酶：
Bcl I
TGATCA ACTAGT
BamH I
GGATCC CCTAGG
T ACTAG
GATCC G
五、限制性核酸内切酶的反应条件


1962年W.Arber提出细菌限制修饰的原理： 菌体中含有2种以上功能不同的酶； 一种（RE）能识别特定核酸序列，切断外来 DNA分子，限制其繁殖，是菌体的防御系统； 一种（修饰酶）也能识别RE所识别的序列， 其作用是通过使特定碱基甲基化而保护核酸， 避免被RE降解，是菌体的自身保护系统
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d

第二章：分子克隆的工具酶

第二章：分子克隆的工具酶

加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20

第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)

第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)

噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。

常用工具酶

常用工具酶

1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象，就是细菌的 限制（限制酶）-修饰（甲基化酶）系统。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异 识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在 这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 ，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCG AT AGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT T GGCTA
4.识别位点在DNA分子上出现的频率
推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有 用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶 序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶 切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的 DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096） 。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现 频率并不均等。
二、连接酶的类型
大肠杆菌DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码Байду номын сангаас，以NAD+作为能源辅助因子； T4 DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子，是基因工程中常用的连 接酶。
三、DNA连接反应的条件
连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合 不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性 末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开，所以通常在 4-15℃连接。

基因工程的工具酶

基因工程的工具酶

用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针

基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶

基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ

03 工具酶

03 工具酶

transformation
S3 DNA聚合酶
SAGE（基因表达系列分析）
影响RE活性的因素
1、DNA的纯度 ——DNA制备时的残余物质抑制RE酶活
如：蛋白质、苯酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS、NaCl等
1）进一步纯化DNA
2）增加酶量 3）延长酶切时间
4）扩大反应体积——稀释抑制因子
影响RE活性的因素
2、DNA的结构



影响用酶量：超螺旋质粒DNA（或病毒DNA）>线 性DNA 有些酶的切割效率受邻近核苷酸成分影响 保护性碱基
03 工具酶
S1 S2 S3 S4 S5 S6 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶 核酸外切酶 单链核酸内切酶
S1 限制性内切酶



工具酶概述 限制与修饰 RE的命名 限制性内切酶（RE）的类型 II型RE的特性 双酶切、完全酶切、部分酶切 RE的影响因素
工具酶概述
同聚物加尾法
衔接物法
双衔接物法



避免DNA分子自我环化 实现定向克隆 便于从载体上切除
接头法
接头法
热稳定的DNA连接酶

DNA连接酶最适温度：37℃
实际操作温度：4-16℃ 热稳定的DNA连接酶（thermostable DNA ligase）：85℃ ，94℃
连接酶链式反应（LCR） ——指数级扩增靶序列 寡核苷酸连接测定（OLA） ——检测靶序列中的单碱基取代、插入、缺失

识别序列：非回文序列
切割位点：下游5-20bp
应用：SAGE（基因表达系列分析）
（Series Analysis of Gene Expression）

第二章 分子克隆工具酶

第二章 分子克隆工具酶

2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。

o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。

这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。

o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。

常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。

表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：

第二章 生物技术常用的工具酶

第二章 生物技术常用的工具酶

例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌（Escherichia coli) R株分离 的第一种限制酶命名为EcoRⅠ， 其中E 代表属名 （Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系 （RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
Hind Ⅲ
属 种 株 序
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
Sau3AI的酶切位点为GATC，但胞嘧啶“C”被甲 基化（修饰）后，Sau3AI的内切酶活性即被抑制。
二、限制酶的分类
• 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性 等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I类和Ⅲ类酶 不适用于基因工程。
• 基因工程所用的酶一般为Ⅱ类酶。 Ⅱ类酶的特点： Ⅱ型核酸内切限制酶仅有内切核酸酶的活性，而没 有甲基化酶的活性； 反应条件需Mg2+； 对DNA的水解有很强的特异性，它要求严格的识别 序列和切割点。
第二章 生物技术常用的工具酶
使核酸降解的核酸酶类（核酸内切酶和核酸 外切酶） 催化核酸合成的酶类（DNA聚合酶、RNA 聚合酶、DNA连接酶等） 核酸修饰酶类（甲基化酶、激酶、核酸转 移酶、磷酸酶等）
3′→5′外切酶 5′→3′外切酶
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸。 磷酸酶：是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。 核苷酸转移酶：催化核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。 甲基化酶：是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。 核苷酸激酶：催化ATP的γ -磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端生成ADP的反应。
1μL
1μL 1μL
四、 使用时的注意事项

1) DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2) 只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；

分子克隆常用工具酶

分子克隆常用工具酶
Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分
离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有 低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI ／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl 为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其 最大特性是耐高温和无核酸酶活性
第二章 分子克隆常用工具酶
Tel: 87286939 Office: 园林楼620
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
植物基因工程
Replication
2)平末端DNA片段的连接
a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转
移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA 连接酶进行连接 c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链

第二章基因工程中常用的工具酶

第二章基因工程中常用的工具酶

第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。

双链结构的核酸内切酶。

到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。

种以上不同的核酸内切限制酶。

核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。

型限制酶。

2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

表示分离到的第三个限制酶。

Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。

ch2-1-工具酶-限制性内切酶

ch2-1-工具酶-限制性内切酶

Restriction/Modification Systems
Restriction endonucleases are categorized into one of four general groups (Types I, II, III, and homing endonucleases based on their subunit structure, cofactor requirements, specificity of cleavage, and associated methylase activity.
4. 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease) 是一类能够识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使 每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 (endo-deoxyribonuclease)。
Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes).Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).
基化状态发挥相应的酶活性，或修饰或切割。切割位点
与识别位点相隔1-5kb。 4） I类限制性内切酶的种类较少，研究的较多的有大肠杆 菌的EcoK和EcoB。

2基因工程-工具酶

2基因工程-工具酶
酶 HindIII Sma I 最适温度oC 37 25 酶 Apy I BstE II 最适温度oC 30 60 酶 Ban I BsmBI 最适温度oC 50 55



4.DNA的分子结构： DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影 响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA量高出很多倍。 5.缓冲液：影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓 冲液。化学组成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定。

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：识别并切割特异的双链
DNA序列的一种内切核酸酶。[单位定义]在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合 物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写 第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字 母，小写 第4个字母代表株，小写 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制 酶的编号

8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
以上序列中部分字母代表的碱基如下：

R=A或G；Y=C或T；M=A或C；K=G或T；S=C或G；W=A或T H=A或C或T；B=C或G或T；V=A或C或G；D=A或G或T；N=A或C或G或T
特性
限制和修饰活性 内切酶的蛋白结构 限制作用所需要的 辅助因子 宿主特异性识别 切割位点 酶催转换 DNA易位作用 甲基化作用的位点 识别未甲基化的序 列进行切割 序列特异的切割 基因工程中的用途

生物技术课件——基因工程常用工具酶

生物技术课件——基因工程常用工具酶

HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
28
也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
h
1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』

第二章目的基因连接及导入 PPT

第二章目的基因连接及导入 PPT
时在T4DNA连接酶得作用下同样能连接起来。
质粒
产生平末端得 内切酶
目得基因
核酸酶S1
重组质粒
DNA连接 酶
本法适用于在质粒
与目得基因上没有相 同得酶切位点！
(三) 人工接头法
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割, 产生粘性末端→连接,构建重组DNA。
用接头连接
+
目得基因 质粒
用同一种 限制性内切酶酶切
基因工程之
第六节 重组DNA导入受体细胞
转—重组DNA导入宿主细胞
在目得基因与载体连接成重组DNA分子以 后,下面得重要工作主要就是将其导入受体细 胞进行扩增与筛选,获得大量得重组DNA分子, 这就就是外源基因得无性繁殖,即克隆 (cloning)。
由于外源基因与载体构成得重组DNA分子 性质不同、宿主细胞不同,将重组DNA导入宿 主细胞得具体方法也不相同。
工具酶:基因工程中得工具酶主要包括用于DNA与RNA 分子得切割、连接、聚合、逆转录等相关得各种酶类。
几种重要得工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异碱基序列,切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA
切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚尾
DNA 连接酶(DNA ligase)能催化双链DNA片段紧靠在 一起得3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使末 端连接。
E. coli DNA 连接酶
只能催化互补粘性 末端之间得连接
T4 DNA 连接酶

生物化学课件 第二章 重组DNA技术

生物化学课件 第二章 重组DNA技术

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克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
特点 以mRNA作为模板,以dNTP为底物， RNA指导 的DNA聚合酶 (RDDP，RNA-dependent DNA polymerase ) 种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV） Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV) 用途： （1）逆转录合成cDNA （2）补平或标记5’粘端 （3）DNA测序 （4）制备探针
库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
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（三）DNase I
1. 特点：
内切酶，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特 异型（随机切割），产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。
2. 用途：
1) 切口平移法，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
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重组DNA技术中常用的工具酶
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3、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase )
特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。 具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺 乏3’ 5’ 外切酶活性，因而无校正阅读功能。
用途：（1）PCR
（2）DNA序列测定
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4、逆转录酶(Reverse Transcriptase ,RTase)

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T4多核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase)
催化将 ATP 的 γ- 磷酸转移到DNA链的 5’ -末端。 用途： （1）放射性标记DNA链的5’ -末端，用于DNA 测序或探针制备。 （2）将人工接头和其它没有 5’ -末端磷酸的
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（1）识别序列与特点 双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。 识别序列长度4 ~ 8 bp。 多数是回文结构。II s型除外。 （2）酶切位点 在识别位点处，切开双链DNA，形成粘
性末端或平齐末端。
图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列
(3) 平齐末端 blunt end
EcoR V ：产生平齐末端。 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
限制酶的命名
图 几种重要的限制酶
图 几种限制酶的识别位点
三、限制性内切酶的分类
分为I 型、II型和III型。
1. I 型限制性内切酶
1968年，首先由M. Meselson和R. Yuan 在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。
（1）识别序列 未甲基化修饰的特异序列：
EcoR I ：5’端凸出
5’-
GAATTC
3’-
CTTAAG
5’-
G AATTC
3’-
CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
Pst I ：3’端凸出
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
③粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互
2. III 型限制性内切酶
与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------
3. II型限制性内切酶
1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先 从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。
(4) 粘性末端 sticky end
含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5´端突出 EcoR I ：形成5’-粘性末端。 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ② 3´端突出 Pst I ：形成3’-粘性末端。 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
二、限制性内切酶的命名
1973年Smith等提出酶的命名原则。
用属名的第一个字母和种名的头两个字 母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌 （Escherichia coli）用Eco表示。用一个 大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一 宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马 字母表示。如EcoR I。
补就可以连接。这比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同 的粘性末端可以连接成环形分子。
图 粘性末端连接
5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
② 不完全同裂酶 识别序列相同，但切点不同。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
五、同尾酶 Isocaudamers
1. 定义 识别序列不同，但能切出相同的粘性末
端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的
新位点，不能再被原来的酶所识别。
5’-GGATCC-3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
Bgl Ⅱ
六、限制酶的活性
限制性内切酶的识别和酶切活性，只有 在最适条件下，才表现出最大酶切能力 和位点专一性。
1. 活性的定义 在适当反应条件下，1小时内完全酶解
1g特定DNA底物，所需要的限制性内 切酶的量，为一个活性单位。
第二章各种工具酶
内容提要
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶)
第一节 限制性核酸内切酶
Restriction endonuclease （RE）
一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
切点距离识别位点约400~7000 bp。不在 识别位点。随机切开一条单链。
如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶 功能，使另一条链甲基化。
如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。
一、概念
1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷
酸序列，并在特定位点切割双链DNA的 内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。
3. 功能
(1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），
能被限制性内切酶识别和降解，从而保 护自身的DNA不被降解。
图 细菌的限制系统
补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
四、同裂酶 Isoschizomers
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
(2) 修饰 Modification
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从 而防止限制性内切酶的识别和水解。
① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入
甲基。
图 细菌的修饰Biblioteka 统图 甲基化位点：DNA上的 A/C