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高效液相色谱法检测克伦特罗的探讨建立高效液相色谱法检测动物性食品中克伦特罗残留量的方法。
方法样品经预处理后，分别以甲醇+水（45+55）和乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）作为流动相对样品进行检测。
结果以乙腈+乙酸铵作为流动相对样品进行检测有较好的峰形，回收率为79.5%～86.4%,浓度在0.50～5.0mg/L范围内的线性为0.9999，检出限为0.05mg/L。
结论用乙腈-乙酸铵为流动相检测克伦特罗的方法是快速、准确可靠，灵敏度高的方法，适合一般基层单位使用推广。
克伦特罗俗称“瘦肉精”，它是一种β肾上腺素，其制剂常用盐酸盐（即盐酸克伦特罗），它最早在临床上作为平喘药应用。
20世纪80年代初，美国氰胺公司意外发现将一定量的克伦特罗加入到饲料中，可加速动物生长，并增加瘦肉率，从而将其广泛应用于养殖业，随后我国也将此方法用于养殖业。
但克伦特罗进入机体后具有半衰期长，代谢和排泄缓慢的特点，其性质稳定不易破坏，人若食用含瘦肉精残留量过高的肉制品后，15min到6h内可出现肌痛、心动过速、头晕目眩等中毒症状。
近几年来，国内外接连发生人食用有瘦肉精残留的肉制品中毒事件，因此引起人们高度的关注。
国家标准GB/T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定[1]中的检测方法有气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫法（ELISA）。
GC-MS法是定性、定量的最佳手段，但仪器昂贵，一般基层单位都没有此类仪器，不利于推广使用；而ELISA法只作为初筛方法，不能定量；一般的基层单位都有HPLC，所以选用HPLC法来进行检测较为适用，从而建立快速、准确、有效的检测方法。
1 材料与方法1.1样品的选择克伦特罗进入机体后，主要分布于肝脏。
因此，肌肉中的含量较肝脏、肾脏低[2]。
因此从市场上采取来自不同猪的肝与肾各2份。
1.2仪器与试剂HP 1100高效液相色谱仪配VWD检测器，盐酸克伦特罗标准（BW 3815，国家标准物质研究中心生产）甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸铵（分析纯）、去离子水其余试剂都是分析纯如：0.1mol/L高氯酸、异丙醇、乙酸乙酯、0.1mol/L磷酸二氢钠弱阳离子交换柱（LC-WCX）（SUPELCO）1.3样品前处理按照国家标准GB/T 5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定[1]的规定用0.1mol/L高氯酸对样品进行提取、再用异丙醇+乙酸乙酯进行萃取，蒸干，再用0.1mol/L磷酸二氢钠定容，最后用LC-WCX净化后等待上机。
“瘦肉精”是一种特定的可用来减少被饲养动物脂肪、增加其瘦肉比例的药物的俗称。
传统型瘦肉精一般是指β－受体激动剂，是一类人工合成的苯乙醇胺类物质，包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、异丙喘宁、氯丙那林、西马特罗与非诺特罗等，其中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺最为常见。
该类药物在动物性食品中的残留会对消费者的身体造成不同程度的影响，对于易感人群危害更为严重[1-2]。
2002年，β－受体激动剂被列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》[3]。
现阶段，对β－受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的检测方法较多。
刘佳等[4]建立了一种检测猪肝中26种β2-受体激动剂药物残留的反相液相色谱-串联质谱方法；金玉娥等[5]也采用液相色谱—串联质谱测定了猪肉和猪肝中11种β2-受体激动剂，上述检测方法取得了比较理想的结果。
但上述研究的前处理过程都比较复杂，一般包括酶解、提取、固相萃取的过程，比较费时费力。
GB/T 21313-2007[6]的检验方法中用高氯酸溶液进行提取，众所周知，高氯酸为强氧化易爆品，具有较高的危险性，在实验室使用具有较大的安全隐患。
本研究对GB/T 21313-2007的检验方法进行调整，用盐酸溶液代替高氯酸溶液进行提取，简化过柱净化程序，提高实验效率，降低上机液杂峰干扰。
1 材料与方法1.1 试验原理试样中β-受体激动剂残留经酶解后，再用盐酸溶液提取，经过滤和离心后，上清液用MCX固相萃取柱净化，液相色谱/串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。
1.2 试验仪器液相色谱Agilent1200；二级串联质谱Agilent6410；万分之一分析天平；水浴锅。
1.3 试剂甲酸（99%）；乙腈，色谱纯；甲醇，色谱纯；乙酸，分析纯，乙酸钠（NaAc·4H2O）；盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液：准确称取0.010 0 g标准品（色谱纯≥99.5%），用甲醇溶解并定容至10 mL，即可得浓度为1 000 mg/L的标准储备液，-18 ℃保存，有效期12个月。
14C-盐酸克伦特罗混饲在猪体内的残留消除研究克伦特罗是一种β-兴奋剂，添加于饲料中能提高几种家畜包括猪的瘦肉率。
由于其在黑市可买到，克伦特罗在欧洲、美国、亚洲非法用于家畜。
在某些国家，非法用过克伦特罗的牛组织中的残留引起人的中毒。
最近有人报道，人食用了含有克伦特罗的猪肉导致中毒。
虽然14C-盐酸克伦特罗总残留和克伦特罗原形药残留在牛和肉鸡体内的消除规律已有报道，但以前没有关于14C-盐酸克伦特罗或非放射性标记的克伦特罗在猪体内的处置和消除规律的报道。
放射性标记作为残留消除规律研究的基础，是因为原形药和其代谢产物的动力学容易估计以及原形药在总残留中的百分比也可估计。
本实验的目的：①测定添加于饲料中的1ppm14C-盐酸克伦特罗在猪体内的处置；②0、3、7天休药期后屠宰，14C-盐酸克伦特罗在猪可食用组织和不可食用组织的分布；③0、3、7天的休药期后，肝、肾、肌肉、脂肪、肺中克伦特罗原形药的浓度。
一、实验9头阉猪和9头母猪购回后，立即称重，打耳号，驱虫，然后分成3组，每组3头阉猪和3头母猪。
实验之前，动物饲喂两周以适应实验环境。
适应期间，训练动物在代谢笼中直到它们可整晚呆在代谢笼。
同时，训练动物采食，一天饲喂两顿，每顿给料量为0.5-0.6 kg/头。
给料30分钟后，通常能完全吃完。
两周后，正式实验，1ppm14C-盐酸克伦特罗添加于饲料中连续7天给药，开始3顿，每顿给料量为0.5 kg/头，随后由于观察到每头猪给0.5kg饲料，猪不能吃饱。
因此，以后每顿给料量增加到0.6 kg/头。
通过计算，7天给药期，每头猪总共消耗了8159±8g的添加了14C-盐酸克伦特罗的饲料，每头猪消耗的14C-盐酸克伦特罗总剂量平均为76.1μCi，即8.3 mg克伦特罗。
停药后的0、3、7天，随机从每个试验组挑选1头阉猪和1头母猪屠宰，即每个休药期屠宰3头阉猪和3头母猪。
屠宰后，采集各种组织样品，如肝、肾、肺、脾、胃肠道、皮肤、脑、眼睛、心、胆汁、脂肪、肌肉，冷冻保存，然后对样品进行分析处理。
盐酸克伦特罗检测方法
盐酸克伦特罗是一种常用的抗抑郁药物，在临床上应用广泛。
为了确保其药效和安全性，需要对其进行检测。
目前常用的盐酸克伦特罗检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等。
其中，高效液相色谱法是最常用的方法之一，其优点是操作简单、准确性高、重现性好，可以同时检测多种成分。
气相色谱法则可以提高检测的灵敏度和选择性，但对样品的纯度要求较高。
质谱法则可以快速确定化合物的结构和含量，但设备和技术门槛较高。
在进行盐酸克伦特罗检测时，需要注意样品的制备、选取合适的检测方法和仪器，以及严格控制实验条件和质量控制。
同时，还需要根据药物的特性和使用情况，结合临床数据进行分析和解释，确保检测结果的准确性和可靠性。
总之，盐酸克伦特罗的检测方法是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素并采用有效的措施来确保检测结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
高效液相色谱内标法测定动物饲料中盐酸克伦特罗邸万山【摘要】以茶碱为内标物,建立高效液相色谱内标法测定禽畜饲料中盐酸克伦特罗的检测方法.样品经三氯乙酸溶液提取,经过OasiaHLB固相萃取小柱(3mL/60 mg)处理,再用体积分数为5％的甲醇溶液冲洗后,采用Nova-Pak C18色谱柱(3.9 mm×150 mm×5 μm)分离,以乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液(25∶75,V/V)为流动相进行洗脱,流速0.8 mL/min,检测波长210nm.结果表明,茶碱在该条件下能够与盐酸克伦特罗分离完全,可以作为测定盐酸克伦特罗的内标物.盐酸克伦特罗的加标回收率为97.8％～99.2％,精密度试验结果的相对标准偏差(RSD)为0.13％,表明该方法操作简单、准确度高、精密度良好,可用于饲料中盐酸克伦特罗含量分析.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)006【总页数】4页(P170-173)【关键词】高效液相色谱法;内标法;茶碱;盐酸克伦特罗;饲料【作者】邸万山【作者单位】辽宁石化职业技术学院应用化学系,辽宁锦州 121001【正文语种】中文【中图分类】TS207.3盐酸克伦特罗（clenbuterol hydrochloride）又称咳喘素、瘦肉精，是β-肾上腺素兴奋剂，其作用机理和肾上腺素相同。
当其用于家畜饲养超过治疗剂量几倍时，可以产生瘦肉含量更高的酮体，加快肉用家畜的生长速度。
1990年欧洲发生了食用残留β-兴奋剂的牛肝引起的食物中毒事件后，欧盟颁布了法规禁止β-兴奋剂作为生长促进剂使用［1］。
我国农业部已明令禁止在家畜饲料中使用盐酸克伦特罗。
关于饲料中β-兴奋剂的检验方法报道较多，其中液相色谱法主要以外标法测定盐酸克伦特罗［2-3］，而用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法内标法测定饲料中盐酸克伦特罗国内外报道较少。
作者简介丁芳林(65),男,湖南生物机电职业技术学院副教授。
2f @收稿日期6第23卷第5期2007年10月
Vol .23,No .5Oct.2007
高效液相色谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的研究
Study on the detec ti on of Clenbuterol Hydrochl oride in pork
by high 2perf or m ance liquid chro m at ography
丁芳林
D I NG F ang 2lin
张朝辉
ZHANG Zh ao 2hu i
谭胜国
T AN Sheng 2gu o
廖三赛
L I AO San 2sa i
(湖南生物机电职业技术学院,湖南长沙 410127)
(Hunan B iologica l and E lectro mechanica l P olytechnic,Changsha,Hunan 410127,China)
摘要:建立猪肉中盐酸克伦特罗的高效液相色谱检测方法,得到最佳色谱条件:流动相为甲醇∶水=26∶74,色谱柱采用
ODS 2C18柱,检测波长为244n m 。
该方法检测线性良好,操作简单、快速,峰形理想,重现性好,结果准确可靠。
关键词:猪肉;盐酸克伦特罗;高效液相色谱法
Ab stract:The m et hod of det ecti on of Clenbu t erol Hydroch l ori de i n po rk by High 2Perfor m ance L iquid Chrom at ograp hy Was estab lis hed .And the bes t ch r om at ograp hy cond iti ons was f ound,t hat is :The mobi l e phas e was methanol 2water (26∶74),ODS 2C18colum n was used and t he det ection wavelength was 244nm .
The li near range of deter m ination is well .And
the m ethod is si mp le and rap id w it h good rep roducibili t y and accurate .Keywor d s :Pork;Clenbuterol Hyd r och l oride;HP LC
随着生产水平的提高,肉类食品的安全越来越受到人们的关注
[1]
,肉类食品中药品残留的检测方法也在不断完
善[2]。
盐酸克伦特罗,化学名为“22[(叔丁氨基)甲基]242氨基23,52二氯苯甲醇盐酸盐”(结构式见图1),是一种天然儿茶酚胺衍生合成的化合物,又称盐酸双氯醇氨、氨哮素、克喘素
[1]。
它最早作为止喘药用于防治哮喘和支气管痉挛。
因
其对动物具有明显促进生长,增加瘦肉率、减少脂肪含量,改善生产性能等作用,曾被加在饲料中,用于牲猪饲养,又称为瘦肉精[3]。
含有“瘦肉精”的猪肉如果被人食用后,会产生心悸,面颈、四肢肌肉颤动,心律失常等副作用,严重影响人类的健康,我国已禁止使用
[4]。
而为了追求更大的商业利
润,我国部分地区的饲料加工企业和养猪专业户将它作为
“秘密武器”———将违禁药盐酸克伦特罗加入他们的产品中,
严重危及到了人的健康。
目前,因食用含残留盐酸克伦特罗
的肉制品引起的“瘦肉精”中毒事件,已引起广泛关注。
因此,在临床医学和食品安全中,动物肉及其制品中盐酸克伦特罗含量的测定具有非常重要的意义。
国内外文献报道用于盐酸克伦特罗残留检测的方法很多
[5,6]
,主要有气相色谱
法(GC )、气相色谱-质谱联用法(G C 2M S )、高效液相色谱法
(HP LC)等[7,8]。
本试验建立了测定猪肉中的盐酸克伦特罗
的高效液相色谱法,该方法操作简单、快速,峰形理想,在所测浓度范围内显示出良好的线性关系,重现性好,结果准确可靠。
图1 盐酸克伦特罗的结构式
1 试验材料与方法
1.1 材料与仪器
甲醇:色谱纯;
试验用水:均为超纯水;其余试剂:均为分析纯;
盐酸克伦特罗标准品:中国药品生物制品检定所;盐酸克伦特罗标准溶液:取盐酸克伦特罗标准品
24.98mg 置于25mL 容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,
配成含盐酸克伦特罗1mg/mL 的标准贮备液,贮于冰箱中,不同浓度的系列标准溶液由标准储备液稀释而得;
Dionex AT330(美国)高效液相色谱仪:由P680四元泵、UVD U 紫外检测器和T33恒温箱组成;
超声波提取器(S B 25BT D);
:19-E ma i l :d i ng anglin
:2007-0-11
170A 02002
11
离心机(6000r/m in);
DSY22型电热恒温水浴锅。
1.2 色谱条件
色谱柱采用Diamonsil ODS2C18柱(5μm,150mm×4.6mm I.D);检测波长为244n m;流动相甲醇∶水= 26∶74;流速1.0mL/m in;柱温30℃;进样量20μL。
1.3 样品处理
取10g绞碎肉试样,加0.1mol/L高氯酸20mL匀浆,超声提取20m i n,80℃加热30m in,冷却后离心(4000r/m in)15m in。
沉淀加0.1mol/L高氯酸5mL洗涤、离心,将上清液合并,用1mol/L氢氧化钠调pH至11,加入25mL乙醚,振荡提取20m in,回收有机相,再用20mL乙醚重复萃取2次,合并有机相,蒸发至干。
用0.1mol/L HC1溶解,纯水定容至10mL。
2 结果与讨论
2.1 提取条件的确定
盐酸克伦特罗在酸性溶液中易溶于水和乙醇,不溶于乙醚、甲苯、二氯甲烷等,而在碱性溶液中可溶于乙醚、苯等有机溶剂。
本试验用G B/T5009.192———2003高氯酸法提取动物样品中盐酸克伦特罗,然后用1mo l/L氢氧化钠碱化,调pH至11,再用乙醚作萃取溶剂。
2.2 检测波长的选择
通过紫外分光光度计对盐酸克伦特罗标准品的扫描,测得其最大吸收波长在244n m。
2.3 流动相的选择
本试验选用甲醇∶水=26∶74作流动相,峰形和分离效果很好,色谱图见图2,因此选用甲醇∶水=26∶74作为最佳流动相。
图2 盐酸克伦特罗标准溶液(20μg/mL)色谱图
2.4 线性关系和方法的精密度考察
精密吸取标准贮备液分别置于50mL容量瓶中,加纯水稀释至刻度,摇匀,配成含盐酸克伦特罗1,2,5,10,20μg/mL 标准系列液,按色谱条件分别进样μL。
以浓度(L)为横坐标,峰面积为纵坐标作图[],得到的线性回归方程:
Y=0.4141X+0.2367
相关系数r=0.9998
以信噪比S/N=3(本仪器最低噪音为5μAU)时的相应浓度来确定方法的最低检测限,测得最低检出浓度为0.5μg/mL。
以加标样品浓度为2μg/mL和5μg/mL的2个样品考察方法的回收率和相对标准偏差(RS D),其结果见表1。
由表可知,色谱峰面积在所测的浓度范围内与浓度具有良好的线性关系。
表1 盐酸克伦特罗加标样品的回收率和
相对标准偏差(RS D)(n=10)
浓度/(μg mL-1)相对标准偏差/%回收率/%
2 4.096.3
5 3.397.2
3 结论
本测定选用甲醇∶水=26∶74作流动相,峰形很好,峰形理想,无拖尾现象,5m in出峰,时间合适,分离效果满意。
样品处理上,用乙醚作萃取溶剂,简化了操作,取到很好的富集效果;同时采用甲醇溶解标准品,图谱出现非常大的试剂峰,掩盖主峰,分离效果不理想,无法进行分析,采用纯水溶解对照品,消除溶剂峰,峰形尖锐,效果较好。
与其他方法相比,本文介绍的方法具有定性定量准确等优点,能满足质量控制的要求,可用于畜肉中盐酸克伦特罗的含量测定。
参考文献
1 李正明.食品安全体系的建立与运作[J].食品与机械,2002(2): 4～5.
2 郭伟,张春晖.液相色谱-电喷雾质谱测定肉类中的磺胺类药物[J].食品与机械,2006(4):84～87.
3 韩森,马国霞,李卫芬.盐酸克伦特罗检测技术的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2006(2):33～35.
4 王德强,新德,安宁.猪禽盐酸克伦特罗残留分析与对策[J].新疆畜牧业,2006(1):14～15.
5 S chlupp A,Aniels k i P,Thie m e D,et al.The beta—agonist elenbuter o l in m ane and tai l hair of ho rses[J].Equine V et.J.,2004,36(2): 118～122.
6 王选年,康晓迪,潘耀谦.盐酸克伦特罗的残留及检测[J].动物医学进展,2002,22(3):41～46.
7 肖红玉,刘国艳,史贤明.盐酸克伦特罗的检测方法[J].中国饲料,2005(12):31～33.
8 林奕芝,刘奋,戴京晶.高效液相色谱法测定肉与肉制品中盐酸克伦特罗残留量[J].中国卫生检验杂志,2002,12(2):180～181.
陈尚卫高效液相色谱法同时测定蛹虫草中四种核苷类活性成分[]食品与机械,6(6)～
3
安全与检测 2007年第5期
1.220 m g/m99.
J.200:107109.
1
1。
