出口中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法编制说明

《出口中药材中氨基甲酸酯类农药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》编制说明一、项目概况1、标准来源本标准修订工作是按照2012年国家出入境检验检疫第二批行业标准制（修）订计划项目《出口中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法》（计划编号：2012B439）执行的。

按照国家标准GB 1.1《标准化工作导则》的要求和《出口商品中农兽药残留及生物毒素检验方法标准编写基本规定》(以下简称《规定》)，对《出口中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》进行制定，我局组织有关人员进行了室内验证实验，并经质检系统内、外共5家单位进行了协同验证试验，本方法的各项技术指标均满足残留分析的要求。

本标准由中华人民共和国上海出入境检验检疫局承担研究起草。

2、目的和意义随着人类社会的进步，食品安全正成为各国政府大力关注并潜心研究的问题，欧、美、日等都将主要注意力放在加强对食品安全的研究、监测、标准制定以及应急反应机制上。

其中中药材是我国特有的传统产品，进出口贸易额不断扩大，是世界主要出口国家。

2009年，中药材进出口总额5.4亿美元，其中出口5.0亿美元；2010年进出口总额8.8亿美元，其中出口8.0亿美元；2011年上半年，进出口总额5.8亿美元，出口5.1亿美元。

氨基甲酸酯类（carbmates）农药是一类新型杀虫剂，因其高效、低毒、低残留的特点而被广泛应用并将取代有机氯和有机磷类农药。

目前它是蔬菜中的重点检测品种。

这类农药的优点在于它的广谱抗虫性和低毒性。

有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的共同毒理机制是抑制昆虫体内乙酰胆碱酶（Ache）和羧酸酯酶的活性，造成乙酰胆碱（Ach）和羧酸酯的积累，影响昆虫正常的神经传导而致死。

只是前者对乙酰胆碱酯酶的抑制是不可逆的，伤害性更大。

而氨基甲酸酯也有被用于人类的药物，如乙酰胆碱酯酶抑制剂----新斯的明和利凡斯的明药品。

中药材的人工种植已较为广泛，种植过程的失范、指导药典的长期落后是中药材行业乱象的主要根源，其中我国在枸杞、人参、当归和三七中均有农药不合格的报道。

同时中药材中氨基甲酸酯农药残留的法律法规暂时还没有，无任何限量要求。

由于氨基甲酸酯类农药极性强，热稳定性较差，在高温下易发生分解，用GC或GC-MS并不理想；液相色谱-串联质谱法的检出限低、选择性强，是一种高效、高灵敏的检测方法。

中药材农残的检测，在我国主要有有机氯、有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯四大类。

2010版药典规定使用GC测定中药六六六、滴滴涕及五氯硝基苯3类共9种有机氯农残。

规定甘草、黄芪有机氯类六六六不得过千万分之二、滴滴涕千万分之二；五氯硝基苯千万分之一。

目前，中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的液相色谱-串联质谱法国未见报道。

本实验结合ASE萃取固相处理技术，建立了测定中药材中12种氨基甲酸酯类（灭多威、异丙威、西维因、仲丁威、猛杀威、残杀威、克百威、恶虫威、灭蚜威、灭虫威、3-羟基－克百威和抗蚜威）农药残留的液相色谱-串联质谱检测方法，适用于济银花、苏叶、杭菊、甘草、山楂、白芷、黄连、枸杞、人参、红花等中药材的基甲酸酯类农药残留澈。

与的HPLC方法相比，本方法具有更快的分析速度、更高的分离和灵敏度，可以满足中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的检测要求。

表1 12种氨基甲酸酯化合物信息中文通用名英文通用名CAS号分子量分子式结构式1.灭多威methomyl 16752-77-5 162.2 C5H10N2O2S2.异丙威isoprocarb 2631-40-5 193.12 C11H15NO23.西维因carbaryl63-25-2 201.22 C12H11NO24.仲丁威fenobucarb 3766-81-2 207.27 C12H17NO25.猛杀威promecarb 2631-37-0 207.27 C12H17NO26.残杀威Propoxu 114-26-1 209.24C11H15NO37.克百威carbofuran 1563-66-2 221.25C12H15NO38.恶虫威bendiocarb22781-23-3 223.23 C11H13NO49.灭蚜威ethionfencarb29973-13-5 225.31 C11H15NO2S10.灭虫威methiocarb2032-65-7 225.31 C11H15NO2S11.3-羟基－克百威carbofuran-3-hydroxy16655-82-6 237.25 C12H15NO412.抗蚜威pirimicarb23103-98-2 238.29 C11H18N4O23、方法概述（1）研究目标化合物的确定：12种氨基甲酸酯。

见表1。

（2）检测方法：食品中氨基甲酸酯类的检测方法现有主要有GC、GC/MS、HPLC以及LC-MS/MS等，但中药材中的检测方法尚缺。

故采用LC-MS/MS检测技术能充分发挥高效液相色谱的高速、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，采用多反应监测扫描模式可提供特征的母离子及其子离子信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。

（3）方法低限的确定：目前中药材中没有氨基甲酸酯类农药限量标准，大多数的农药残留来自种植中药材的土壤中，同时也为了达到违规使用，因此本方法的检测低限设定为0.0125 mg/kg。

（4）本方法经ASE提取效率试验，净化方法选择试验，测定方式选择试验，液相色谱-质谱/质谱法条件试验，回收率试验，精密度试验，方法验证试验。

结果表明，各项技术指标均完全满足残留检测需要。

二、实验技术论证1. 提取溶剂和净化条件的选择根据氨基甲酸酯类农药的特性，选择了多种溶剂进行提取研究。

选择了乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂。

乙腈的极性较大，提取的效果较好。

又因中药材的特性，特别是采用ASE溶剂萃取，即极大提高提取效率，又能完全萃取。

但ASE溶剂萃取也导致较多的杂质被提取出来，所以选择了石墨碳和氨基复合小柱进一步对样液进行净化。

2、色谱分离条件研究（1）色谱柱的选择本方法选用C18色谱柱，长50 mm，内径4.6 mm，粒径1.8 μm，或相当者，应用液相色谱具有灵敏度高、选择性好等特点来进行测定。

（2）流动相的选择与优化对流速、流动相的比例和洗脱梯度进行优化。

本研究采用电喷雾的电离模式，由于电喷雾是在溶液状态下电离，同时待分析化合物的极性差别较大，因此，流动相的组成对目标化合物的分离和离子源的电离有很大的影响。

本研究考察了对比了乙腈、水、乙酸铵、甲酸等在流动相配比中的色谱分离效果，结果表明，含0.1％甲酸5mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈做为流动相并采用梯度洗脱时，相关化合物的分离度和灵敏度较高。

流动相梯度洗脱条件见表2。

采用0.4 mL/min 的流速，可保持较低的柱压，有利于色谱柱的长期使用。

表2 流动相、流速及梯度洗脱条件3、液相色谱-质谱/质谱/测定条件的选择氨基甲酸酯标准溶液分别以蠕动泵注射的流动注射方式在ESI+离子化模式下进行全扫描以选择适当的电离方式和准分子离子峰。

确定氨基甲酸酯的母离子后，调节仪器参数，使母离子的丰度最大；对进行二级质谱分析，子离子的选择主要考虑每种化合物的质谱图和结构特性，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性、定量离子，通过优化毛细管电压、碰撞能量和碎裂电压等质谱参数，使每种着色剂的准分子离子和特征碎片离子对强度达到最大。

参照CAC和 EU第657/2002/EEC号决议中有关规定，选择两对离子进行MRM监测即可满足。

最终确立的质谱条件如表3所示，多反应监测质谱图见图1。

4.仲丁威208.1 95.1* 20 53 6 3 152.1 12 51 6 95.猛杀威208.1 109.1 20 53 8 6 151.1*11.5 54 9 96.残杀威210.1 111.1* 19.5 49 8 6 168.1 11.0 49 8 67.克百威222.3 165.2* 15.5 55 6 7 123.2 28 54 7 78.恶虫威224.1 167.2* 13 48 6 3 109.1 25.5 50 4 69.灭蚜威226.1 164.1 11.5 50 5 11 107.1* 19 50 6 610.灭虫威226.2 169.1* 12 51 5 10 121.1 23 54 6 711.3-羟基－克百威238.2181.3* 16.5 60 7 11220.3 9 57 14 1412.抗蚜威239.2 195.2* 19 39 12 12 181.1 22.5 38 6 12图1 氨基甲酸酯类农药标准溶液（10ng/L）的质谱图三、方法的线性关系和测定低限曲线在2.5~50.0ug/L范围内线性良好，浓度与峰面积呈正比，相关系数R在0.9755以上（见表4）,方法检出限0.0125 mg/kg。

表 4 12种氨基甲酸酯的线性方程和相关系数化合物线性方程相关系数R灭多威Y=1.04e*005x+6.43e*005 0.9960异丙威Y=1.29e*005x+1.20e*006 0.9809西维因Y=1.36e*005x+1.55e*006 0.9822仲丁威Y=1.08e*005x+1.06e*006 0.9815猛杀威Y=1.63e*005x+1.58e*006 0.9830残杀威Y=1.31e*005x+1.71e*006 0.9755克百威Y=1.81e*005x+1.04e*006 0.9895恶虫威Y=1.10e*005x+1.94e*006 0.9911灭蚜威Y=1.38e*005x+1.94e*006 0.9911灭虫威Y=7.27e*004x+1.31e*006 0.97953-羟基-克百威Y=5.45e*004x+5.67e*005 0.9908抗蚜威Y=1.47e*004x+1.03e*005 0.9966四、方法的室内回收率和精密度本标准方法的室内回收率和精密度实验，以济银花、苏叶、杭菊、甘草、山楂、白芷、黄连、枸杞、人参、红花为空白样品基质，添加三个浓度水平，每个浓度水平进行十次重复实验，空白和添加样品重构离子色谱图见图。

测的的回收率和精密度汇总于表5。

回收率在73.8～110.8%，相对标准偏差在4.4～13.7%，符合残留检测的要求。

五、方法的室间回收率和精密度本方法经上海食品研究所、上海质检院、上海乳品研究所、厦门出入境、海南出入境5家实验室对该标准方法进行了协同验证实验。

验证样品基质为济银花、山楂、人参、，三个添加浓度水平，每个浓度水平进行两次重复实验，协同验证结果汇总于表6。

回收率在68.0-103.3%，相对标准偏差在5.0-11.8%。

图2济银花空白基质图谱图3济银花添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图4苏叶空白基质图谱图5苏叶添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图6杭菊空白基质图谱图7杭菊添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图8甘草空白基质图谱图9甘草添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图10山楂空白基质图谱图12白芷空白基质图谱图14黄连空白基质图谱图15黄连添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图16枸杞空白基质图谱图17枸杞添加回收（0.0125mg/kg）质图谱图18 人参空白基质图谱图20红花空白基质图谱参考文献[1]主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准. 北京：中国标准出版社，2004.[2]Masahiro Okihashi, Hiroaka Obana, Shinjiro Hori .Determintion of N-methlcarbamate pesticides in foods using an accelerated solvent extraction with a mini-column cleanp. The Analyst, April 1998,Vol, 123 (711-714de Llasera M P C, González M B. Water Research. 2001, 35(8): 1933～1940.[3]吴刚，王华雄，俞春燕等. 加速溶剂萃取-GPC液相色谱柱后衍生化测定动物源性食品中氨基甲酸酯类农药残留量[J].中国食品卫生杂志，2008，20（5）：409-412[4]孟辉，刘晨明.中药材黄芪中农药残留量检测方法研究[J].辽东学院学报，2009，16（1）：23-26[5]郭华，荣维广，潘东.中药材丹参中农药多残留量SPE-CGC检测方法研究[J].南京农业大学学报，2006，，29（1）：112-115[6]陈安珍，田金改，杜庆鹏.中药材中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的快速检测方法[J].中国药事，2009，23（11）：1063-1065[7]郭宇珠，鲍燕燕，蔡清宇等.中药材中残留农药的检测方法[J].华西药学杂志，2006，21（5）：471-473[8]蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的检测. 中华人民共和国农业行业标准. NY/T 761-20096 方法的室间回收率和精密度验证试验结果。