细胞工程第五章生物制品生产改

细胞工程第五章生物制品生产改
工作原理
反应器运转时，圆筒以30-60 r/min的速度转动， 由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅 拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流 筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气 腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔 丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的 气体成分均匀地分布到反应器内。
• 细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而 无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。
• 细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室， 从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。
• 在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流 出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核 形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。
悬浮培养
§ 与微生物的肉汤培养基本相同。 § 悬浮培养细胞增殖快、产量高，没有接触抑
制特性，是动物大规模培养的理想方法。 § 但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，
适用于确立细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿 瘤细胞、血液和淋巴细胞培养。
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微载体培养
§ 微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和 增殖，微载体悬浮于培养液中。
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• Celltech公司采用气升式反应器培养 杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。生产周期为 14~400h。从10L逐级放大到10000L。17d生 产抗体100g，抗体合成大多数处于稳定期和 衰退期，比传统摇瓶提高约5倍。
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• 广泛使用的有：Cellsnow、Cytocell（纤维 素基质）、Verax、Cultisphere（胶原）、 Cytoline 1和2（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡 胶）及Siran（玻璃）等。
• 主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。
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•培养基分散后,
灌入床层。纤
维管壁薄，半
透膜，截留不 培
同分子量。
养 基
入
•纤维管的空腔 口
组成的内室：
灌流含氧气的
培养基
•纤维管之间的 空间组成的外 室：细胞生长。
• •
•接种孔 水套层 产物出口
产 物 出 口
•培 养 基 入 口
•腔室
•细胞
•内膜 •外膜
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§ 微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的 比表面积，供单层细胞贴附和增殖。
§ 悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高， 重复性好，容易放大。
§ 20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿 激酶原等。
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v 理想的微载体所具备的性能：
v 质地柔软，微球间摩擦轻；
葡聚糖微载体：带正电，干粉在pH7.2的磷
酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。
Cytodex 2：电荷性大大下降，吸附能力很低，
适合于蛋白质药物的生产。
纤维素微载体DE52和DE53：适合多种细
胞培养。
聚丙烯酰胺载体：贴壁较快，亲水性。
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•多孔微载体：
• 直径0.2～5 mm，孔径20～300 μm，达占总 体积的85%，极大地增加了比表面积，可实现细 胞的固定化，达到高密度培养。
常见的动物细胞培养产物
疫苗
小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、 疱疹疫苗、风疹疫苗
单克隆抗体 IgG、IgM、IgA等
⑤是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模 可达 12000L。
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2、半连续式（流加式）培养
指在分批式培养的基础上，将分批培养的 培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培 养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。
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机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系 统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传 感器，监测培养物的温度、pH值、溶氧 度(DO)、葡萄糖消耗、NH3、NH4+等参数。 这种反应器培养规模可达2 000 L。
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§该系统优点：
（1）设计简单，操作方便，易于放大生产； （2）细胞密度高，达到107/mL以上； （3）便于无菌操作，不易污染； （4）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所需
这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素 的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大 规模生产常用此法进行。
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中空纤维（微导管）培养
§ 是模拟体内细胞三维生长环境而发明的。 § 将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过
的要求。
§缺点：
对细胞损伤较大，产物含量不高。
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气升搅拌式
气体从罐底的喷射管进入反应器的导 流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞 与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤 害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良 好。适用于悬浮细胞分批培养、微载体和连续
培养。
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§ 该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入 RCCS圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容 器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水 平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋 转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气 体交换器来吸氧和排出CO2。
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微囊化培养
利用固定化细胞技术，将一定量细胞与 约4％的褐藻酸钠混合后，滴到CaCl2溶液中，
构成半透性微胶囊。又称固定化细胞、大载 体培养法。
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1） 细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养， 又可排出自身代谢物。
2）细胞所受的剪切力损伤小， 细胞生长良好， 纯度提高。便于连续培养，提高培养细胞的 利用率；
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二、大规模细胞培养方法
按供养方式分为三种：
搅拌式、气升式、旋转式
按细胞固定分为四种：
悬浮培养、 微载体培养、 微囊化培养、 微导管培养（中空纤维培养）。
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机械搅拌式(Spinner)
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4、连续灌注式培养
是把细胞接种后进行培养，新鲜的培 养液不断从反应器一头加入，从另一头不断 取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内， 使细胞处于一种营养不断供应状态。使反应 条件处于一种恒定状态。
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连续灌注式培养特点
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第二节 动物细胞生物制药
用动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋
白质，特别是人源细胞的培养，在药物生产中
的位置越来越重要。
一、表达蛋白的宿主系统
二、生产用动物细胞的要求
三、常用动物细胞的特性
四、基因工程细胞构建和筛选
五、细胞库的建立
PPT文档演模板ຫໍສະໝຸດ 细胞工程第五章生物制品生产改
悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮 酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。
将这些微载体悬浮在培养液中，大大增 加细胞的贴壁面积，可使每毫升培养基达到 1000万个（108）细胞的密度。
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常用微载体
玻璃珠：直径约2～3 μm，密度1.5 g/cm3。
在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此 密度。
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开放式连续培养----细胞随排出培养液一起流出 且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率 等于培养系统中新细胞的增长速率。
封闭式连续培养----新鲜培养液和老培养液以等 量方式进出，而收集的细胞重新放入原培养 系统中继续培养，故培养系统中细胞数量是 在不断增加的。
3）细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代 谢产物的积累，提高产量。
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4）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、 收获步骤，提高工作效率。如次生代谢物不分 泌， 培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗 体。
5）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的 遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。
§ 由于系统无推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减 到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行 三维生长，得到类似人体内的培养产物.
§ 近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百 种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。
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一、细胞培养的操作方式 二、大规模细胞培养系统
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一、细胞培养的操作方式
培养方式分为： 分批式 流加式培养 半连续式 连续灌注式
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1、分批式培养
指先将细胞和培养液一次性装入反应器 内进行培养，细胞不断生长，产物不断形 成，经一段时间后，终止培养。