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糖类化合物的研究 糖类化合物是构成⽣物体的四⼤基本物质之⼀，⽣物学家曾经长期认为糖类化合物的⽣物学功能只是作为能量物质如动物体内储存的糖原和植物体内储存的淀粉，及作为结构物质如纤维素、⼏丁质等。
长期以来由于认为糖在⽣物有机体内的作⽤远在蛋⽩质及核酸之下，其功能在很长时间内未得到应有的重视。
近年分⼦⽣物学、细胞⽣物学和⽣物化学等的发展使⼈们不断认识到糖类物质除储能之外还有其它诸多⽣物学功能，同时⼤量的实验结果也揭⽰了糖类物质是重要的信息分⼦，参与许多⽣理和病理过程，其中包括参与⽣物体受精、发育、分化、免疫、神经系统的识别与调控；在微⽣物与动物、植物的相互作⽤中担负重要作⽤；在衰⽼、癌症过程中也涉及到糖类物质的参与。
⽣物学功能及应⽤ 1、寡糖是⽣物体内重要的信息物质 缀合物通过寡糖链的识别作⽤决定着细胞的识别、集聚及受体作⽤。
例如，⾎细胞表⾯的糖蛋⽩和糖脂决定了⾎型，由于这些糖缀合物中寡糖⾮还原端糖的种类和结构的不同⽽产⽣了不同的⾎型。
最新研究表明，寡糖不仅以它们的缀合物在起作⽤，很多寡糖本⾝就有重要的⽣理功能，有的寡糖能激活植物的⾃我防卫系统，有的寡糖能诱导根瘤菌的固氮作⽤，有的寡糖则以与⼊侵的微⽣物上的糖蛋⽩相结合⽽阻⽌这些微⽣物对⼈体正常细胞的侵袭，有的寡糖具有抗菌、抗病毒及提⾼免疫活性的功能，⽽⼀些寡糖则具有肝素的功能，⾎型决定族寡糖更是很有希望成为防治癌症的药物。
2、寡糖具有营养保健功能 由于⼈体不具备分解、消化寡糖的酶系统，在摄⼊之后，它很少或根本不产⽣热量，可有效地防治肥胖、⾼⾎压、糖尿病等。
⽽且寡聚糖是⼀类重要的双歧杆菌促⽣长因⼦（bifidusfactor,BF），它能有效地促进肠道内双歧杆菌的⽣长繁殖。
BF通过促进双歧杆菌⽣长繁殖表现其主要⽣理功能，如提⾼⼈体免疫⼒；降低肠道内pH值；抑制肠道有害菌⽣长；产⽣B族维⽣素；分解致癌物质，促进肠蠕动；增进蛋⽩质的吸收等。
除此以外天然的纯寡糖还有预防蛀⽛、降低⾎脂及促进矿物质吸收等⼗分重要的功能。
寡糖的临床应用寡糖，指的是由两个或多个糖分子组成的低聚糖类化合物，其相对分子量较小，具有一系列特定的功能和生物活性。
近年来，寡糖在临床应用领域备受关注，被认为具有重要的药用和保健功能。
下面将就寡糖在临床应用中的相关内容进行探讨。
一、寡糖的来源及种类寡糖广泛存在于天然食物中，如蔬菜水果、豆类、海藻等，其中以大豆寡糖、木糖寡糖、果寡糖等为代表。
此外，生物技术手段也可通过酶法、微生物发酵等途径生产得到寡糖。
二、寡糖的生物功能1. 益生作用：寡糖可促进益生菌的生长和活性，维持肠道菌群平衡，发挥益生作用，有助于增强免疫功能、改善肠道健康。
2. 抗炎抗菌：寡糖具有良好的抗炎抗菌作用，可减少炎症反应，抑制病原微生物的生长繁殖，对胃肠道疾病、感染疾病有一定的防治效果。
3. 调节血脂血糖：寡糖在体内降解缓慢，有利于控制血糖和血脂，预防糖尿病、高血脂等代谢性疾病。
4. 抗肿瘤：部分寡糖能够抑制肿瘤细胞的生长，具有一定的抗肿瘤活性，对预防和辅助治疗肿瘤具有重要意义。
三、寡糖在临床应用中的形式目前，寡糖已广泛应用于医药、保健品、食品等领域，其产品形式多样，包括片剂、胶囊、口服液、粉剂、保健食品、功能饮料等，满足不同人群的需求。
四、寡糖在临床应用中的适用人群及禁忌症寡糖适用于肠道菌群失调、免疫功能低下、代谢性疾病、肿瘤等人群，但对于某些特殊人群如孕妇、婴幼儿等存在禁忌症，需在医生指导下使用。
五、寡糖的剂量及用法不同种类的寡糖剂量和用法略有不同，一般建议在医生指导下使用，严格按照产品说明书或医嘱使用，不可滥用或超量服用。
六、寡糖的安全性及副作用寡糖作为一种天然产物，安全性较高，一般情况下不会产生严重副作用。
但少数人群可能出现腹泻、胀气等不适症状，建议停止使用。
七、结语总的来说，寡糖作为一种具有多重功效的生物活性物质，在临床应用中发挥着重要作用，但需要注意适用人群、剂量用法以及副作用等问题，以确保其安全有效地应用于临床。
希望随着科学研究的不断深入，寡糖的临床应用能够得到更广泛的认可和应用。
寡糖的重均分子量【原创版】目录1.寡糖的定义和重要性2.寡糖重均分子量的概念3.寡糖重均分子量的测量方法4.寡糖重均分子量的应用5.寡糖重均分子量的研究进展正文1.寡糖的定义和重要性寡糖，又称低聚糖，是由 2-10 个单糖分子通过糖苷键连接而成的碳水化合物。
它们广泛存在于水果、蔬菜和动物乳汁中，具有重要的生理功能，如调节肠道菌群、增强免疫力等。
因此，研究寡糖的性质对于了解其生理作用及开发相关产品具有重要意义。
2.寡糖重均分子量的概念寡糖重均分子量（Average Molecular Weight, AMW）是指寡糖分子量的平均值，通常用克/摩尔表示。
它是衡量寡糖分子量大小的重要指标，对于研究寡糖的结构、功能和生物活性具有重要意义。
3.寡糖重均分子量的测量方法寡糖重均分子量的测量方法主要包括以下几种：（1）凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC）：这是一种常用的测量方法，基于分子大小不同，通过凝胶柱的速率不同，从而实现对寡糖分子量的分离和测定。
（2）质谱法（Mass Spectrometry, MS）：通过质谱分析，可以准确测量寡糖的分子量，但通常需要与其他方法相互验证。
（3）光散射法（Light Scattering, LS）：光散射法通过测量溶液中寡糖颗粒对光的散射程度，推算出分子量。
这种方法简便快速，但准确性相对较低。
4.寡糖重均分子量的应用寡糖重均分子量对于研究寡糖的生物活性、消化吸收、结构特征等方面具有重要意义。
此外，在生产过程中，控制寡糖的重均分子量可以提高产品质量和稳定性。
5.寡糖重均分子量的研究进展随着科学技术的发展，寡糖重均分子量的研究取得了显著进展。
例如，通过改进测量方法和仪器设备，提高了测量的准确性和效率；对于不同类型的寡糖，研究了其重均分子量与生物活性之间的关系，为开发高生物活性的寡糖产品提供了理论依据。
功能性寡糖的种类发展与功效功能性寡糖（functional oligosaccharides）是一类具有特定生物功能的寡糖，通常指的是含有2-10个单糖残基的低聚糖。
它们具有一系列的生理活性和保健功效，可以在人体内发挥积极作用。
以下是功能性寡糖的种类发展与功效的一些主要内容：1. 低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）：低聚果糖是由果糖（fructose）单位组成的寡糖，主要存在于植物中，如洋葱、大蒜和茄子等。
它具有益生菌作用，可以增加肠道内有益菌的数量，抑制有害菌的生长，改善肠道环境。
此外，低聚果糖还可以增强人体的免疫功能，调节血脂和血糖水平。
2. 低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，GOS）：低聚半乳糖是由半乳糖（galactose）单位组成的寡糖，主要存在于乳制品中，如奶粉和乳酸饮料。
它具有益生菌作用，可以促进肠道内双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌的生长，改善肠道菌群平衡，增加肠道黏膜的免疫性，增强抵抗力。
此外，低聚半乳糖还可以促进钙和铁等矿物质的吸收。
3. 低聚甘露糖（galactomannan，GM）：低聚甘露糖是由甘露糖（mannose）和半乳糖（galactose）单位组成的寡糖，主要存在于豆类中，如大豆和豌豆等。
它具有水溶性纤维的特点，可以增加粪便体积，改善便秘问题，调节肠道功能。
此外，低聚甘露糖还可以帮助降低血脂，降低胆固醇的吸收。
4. 低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）：低聚木糖是由木糖（xylose）单位组成的寡糖，主要存在于木质纤维中，如竹子和茅台等。
它具有益生菌作用，可以增加肠道内双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌的数量，改善肠道菌群平衡，增加益生菌的代谢产物，提高免疫力。
此外，低聚木糖还可以降低血脂和血糖，调节肠道功能。
5. 低聚葡甘露糖（inulin）：低聚葡甘露糖是由果聚糖（fructose）单位组成的寡糖，主要存在于植物的根茎中，如朝鲜蓟和菊芋等。
非消化寡糖的生理功能研究进展及其应用I. 内容综述非消化寡糖是一类不能被人体消化道酶水解的多糖，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。
近年来随着对非消化寡糖生理功能研究的不断深入，人们逐渐认识到其在生物医学领域的重要价值。
本文将对非消化寡糖的生理功能研究进展及其应用进行综述。
首先非消化寡糖具有调节肠道菌群平衡的作用，研究表明非消化寡糖能够通过抑制有害菌的生长和促进有益菌的繁殖，从而维持肠道菌群的正常比例，降低肠道炎症反应，改善肠道功能。
此外非消化寡糖还可以增强肠道黏膜屏障功能，保护肠道免受有害物质的侵害。
其次非消化寡糖具有抗氧化作用，研究发现非消化寡糖中的多糖链可以与自由基发生作用，形成稳定的复合物，从而减少自由基对人体细胞的损伤。
此外非消化寡糖还可以增强机体免疫功能，提高抗病能力。
再者非消化寡糖具有降血糖作用，近年来的研究发现，非消化寡糖可以通过多种途径降低血糖水平，如促进胰岛素分泌、抑制肝糖原分解、减缓葡萄糖吸收等。
因此非消化寡糖在糖尿病治疗中具有潜在的应用价值。
非消化寡糖还具有抗肿瘤作用，研究发现非消化寡糖能够通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、调节免疫反应等多种机制，发挥抗肿瘤作用。
此外非消化寡糖还可以减轻化疗药物的副作用，提高患者的生活质量。
随着对非消化寡糖生理功能研究的不断深入，人们越来越认识到其在生物医学领域的重要价值。
未来非消化寡糖有望在肠道健康、糖尿病治疗、抗肿瘤等领域发挥更大的作用。
A. 研究背景和意义随着人类对生物技术的认识不断深入，非消化寡糖作为一种新型的功能性食品添加剂，受到了越来越多的关注。
非消化寡糖是指不能被人体消化道酶水解的单糖和双糖，如低聚果糖、低聚异麦芽糖等。
它们在人体内具有多种生理功能，如调节肠道菌群平衡、促进钙吸收、降低胆固醇等。
近年来研究发现非消化寡糖对人体健康具有显著的益处，如预防心血管疾病、改善肠道功能、增强免疫力等。
因此对非消化寡糖的生理功能进行深入研究，探讨其在食品工业中的应用前景具有重要的理论和实践意义。
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.026302引用格式:李晨晨,李梦丽,张涛.人乳寡糖的研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(9):284-292.LI Chenchen,LI Mengli,ZHANGTao.Research progress of human milk oligosaccharides[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(9):284-292.人乳寡糖的研究进展李晨晨,李梦丽,张涛∗(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122)摘㊀要㊀人乳寡糖(human milk oligosaccharides ,HMOs )是存在于母乳中的一类重要低聚糖,可作为功能性成分添加到婴幼儿配方奶粉中,对婴幼儿生长发育具有重要作用㊂研究表明,HMOs 可以作为益生元维持肠道微生物环境平衡,具有免疫防御调节㊁刺激婴幼儿大脑发育及认知等方面的功能㊂文章对HMOs 的结构组成㊁合成方法以及分离检测进行了总结,以期为后续研究提供基础㊂关键词㊀人乳寡糖;结构;功能;分离检测;合成第一作者:硕士研究生(张涛教授为通讯作者,E-mail:zhangtao@)㊀㊀基金项目:十三五重点研发计划项目(2017YFD0400600)收稿日期:2020-11-28,改回日期:2020-12-23㊀㊀人乳对婴幼儿来说是天然的滋养剂,对其生长发育具有非常显著的效果,并具有很多牛乳粉所没有的,促进健康成长的益生功能㊂其成分复杂且丰富,含有许多生物分子,如免疫球蛋白㊁先天性糖蛋白㊁生物活性肽㊁抗体㊁糖脂㊁游离脂肪酸㊁细胞因子和趋化因子等[1]㊂人乳中主要含有2种碳水化合物:乳糖和人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)㊂乳糖是人乳的主要营养成分之一,具有很高的营养价值㊂HMOs 是人乳中含量仅次于乳糖和脂类的第三大成分,它是200多种不易消化和非营养性碳水化合物的复杂混合物[2]㊂在研究人乳和牛乳之间的各种成分差异中发现,一个主要的差异是人乳中存在HMOs,而在牛乳和目前市场上的婴儿配方奶粉中则几乎没有㊂20世纪30年代,低聚寡糖被认为是母乳中的双歧因子,于1954年GYÖRGY 等[3]就发现并鉴定了母乳中最丰富的低聚寡糖㊂作为母乳中具有益生功能的成分,它可以调节肠道菌群环境,促进有益菌群的生长,还可以作为抗黏附抗菌剂,阻碍病菌与人体肠道黏膜细胞的结合,调节免疫系统,对促进大脑发育也有重要的作用㊂由于HMOs 的种类繁多㊁结构复杂且大多数合成困难,目前市场上出现的婴幼儿配方奶粉中添加的大多是低聚半乳糖(galacto oligosaccha-rides,GOS)和低聚果糖(fructo oligosaccharide,FOS),以此来模拟HMOs 的部分功能㊂目前在HMOs 中,2ᶄ-岩藻糖基乳糖(2ᶄ-fucosyllactose,2ᶄ-FL)和乳酰-N -新四糖(lactoyl-N -neotetraose,LNnT)被广泛研究,与其他母乳低聚糖相比,这2种母乳低聚糖化学结构相对简单,在母乳中含量较为丰富㊂欧盟认定这两者作为新型食品,通过科学和技术资料得出2ᶄ-FL 和LNnT 可以1.2g /L 和0.6g /L 的质量浓度单独或组合添加到婴儿配方奶粉中㊂美国食品药品监督管理局也认证2ᶄ-FL 和LNnT 可作为安全的食品进行添加和使用[4]㊂由于HMOs 的生物学效应,近期婴儿配方奶粉公司,如雀巢㊁强生等,对引入主要的HMOs 至婴儿配方奶粉中产生了极大的兴趣,试图开发尽可能接近母乳的强化配方奶粉㊂但由于价格及合成水平等的限制,目前还没有形成工业化规模生产㊂随着科学的进一步发展,更多种类复杂的HMOs 合成研究会越来越完善,市场化规模的生产也会逐步走向成熟㊂1㊀人乳寡糖的结构与功能1.1㊀HMOs 的结构组成HMOs 是由3~14个单糖组成的低聚糖,主要以游离形式存在于母乳中,其基本单体分为以下5种,分别是D -葡萄糖(Glc)㊁D -半乳糖(Gal)㊁N -乙酰葡糖胺(N -acetylglucosamine,GlcNAc)㊁L -岩藻糖(Fuc)和唾液酸[以N -乙酰神经氨酸(N -acetylneuraminic acid,Neu5Ac)作为主要形式][5]㊂这些单糖以不同的方式结合成结构复杂的200多种低聚糖㊂从结构上来说,通常在寡糖的还原末端存在乳糖结构(Gal-β-1,4-Glc),乳糖通过α-1,2或α-1,3岩藻糖基化和α-2,3或α-2,6唾液酸化的末端能够产生4种低聚寡糖,分别为:2ᶄ-岩藻糖基乳糖(2ᶄ-fucosyllactose,2ᶄ-FL),3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL),3ᶄ-唾液酸乳糖(3ᶄ-sialyllactose,3ᶄ-SL)和6ᶄ-唾液酸乳糖(6ᶄ-sialyllac-tose,6ᶄ-SL),见图1㊂同时,在乳糖结构基础上,以β-1,3或β-1,6键连接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖(Gal-β-1,3-GlcNAc,LNB,I型链结构)或者连接N-乙酰氨基乳糖(Gal-β-1,4-GIcNAc,LacNAc,II型链结构)延伸糖链,可以构建形成HMOs的核心结构,它们被分为四核到十核的核心结构[6]㊂前面4个核心结构分别是乳酰-N-四糖(lacto-N-tetrose,LNT)㊁乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)㊁乳酰-N-六糖(lacto-N-hexaose,LNH)和乳酰-N-新六糖(lacto-N-neohexaose,LNnH),见表1㊂这些主链结构可以被修饰,所以在母乳中HMOs大致可以分为3种类型,岩藻糖基化的HMOs㊁唾液酸化的HMOs和非岩藻糖基化的中性HMOs,其中岩藻糖基化的HMOs和非岩藻糖基化的中性HMOs同属于中性HMOs,而唾液酸化的HMOs则属于酸性HMOs㊂在这之中,中性HMOs 占HMOs总量的75%以上㊂在母乳中分泌最丰富的HMOs是2ᶄ-FL,约占总HMOs的30%,是目前研究最为广泛的低聚寡糖之一㊂由于HMOs的浓度和组成变化很大,其种类和含量随着个体和时间的变化都会呈现差异之处,不同的女性分泌的寡糖类型不同,同一人在不同哺乳时期含量也有所不同,如在成熟乳中约为12~14g/L,而初乳中约为20~24g/L[7]㊂此外,与足月分娩的妇女相比,早产妇女含岩藻糖基化或唾液酸化的HMOs百分比差异更大㊂图1㊀人乳寡糖结构图Fig.1㊀Structure diagram of human milk oligosaccharides表1㊀人乳寡糖的核心结构[8-9]Table1㊀Core structure of human milk oligosaccharides中文名英文名缩写㊀㊀结构2ᶄ-岩藻糖基乳糖2ᶄ-fucosyllactose2ᶄ-FL Fuc-α-1,2-Gal-β-1,4-Glc3-岩藻糖基乳糖3-fucosyllactose3-FL Gal-β-1,4-(Fuc-α-1,3-)Glc3ᶄ-唾液酸乳糖3ᶄ-sialyllactose3ᶄ-SL Sia-α-2,3-Gal-β-1,4-Glc6ᶄ-唾液酸乳糖6ᶄ-sialyllactose6ᶄ-SL Sia-α-2,6-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-四糖lacto-N-tetraose LNT Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-新四糖lacto-N-neotetraose LNnT Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-六糖lacto-N-hexaose LNH Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-(Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-)Gal-β-1,4-Glc 乳酰-N-新六糖lacto-N-neohexaose LNnH Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-(Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-)Gal-β-1,4-Glc 乳酰-N-岩藻五糖I lacto-N-fucopentaose I LNFP I Fuc-α-1,2-Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-岩藻五糖III lacto-N-fucopentaose III LNFP III Gal-β-1,4-(Fuc-α-1,3-)GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-二岩藻糖I lacto-N-difucotetraose I LNDFH I Fuc-α-1,2-Gal-β1,3-(Fuc-α-1,4-)GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc乳酰-N-二岩藻糖II lacto-N-difucotetraose II LNDFH II Gal-β-1,3-(Fuc-α-1,4-)GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-(Fuc-α-1,3-)Glc1.2㊀HMOs的功能HMOs在婴幼儿生长发育的过程中起到不可替代的重要作用,它可以影响肠道微生物群的内在组成,为有益的肠道细菌提供能量来源㊂研究表明, HMOs进入人体后并不被消化吸收,而是直接到达大肠,通过刺激肠道内的有益菌群(双歧杆菌和乳杆菌)的增殖生长,有效抑制肠道有害菌群的繁衍,改善肠道微环境,维护机体的健康状态[10]㊂一些体外研究表明,HMOs可促进某些双歧杆菌的生长,婴儿体内的双歧杆菌在添加HMOs的培养基上生长良好,其中2ᶄ-FL作为碳水化合物的唯一来源㊂随着时间的推移,婴儿双歧杆菌消耗所有HMOs,包括其单糖和双糖代谢物[11]㊂另有研究表明,24个益生菌菌株中,只有来自婴儿的长双歧杆菌亚种ATCC15697和M-63能够发酵2ᶄ-FL㊁3-FL㊁3ᶄ-SL和6ᶄ-SL,所以HMOs可作为婴儿双歧杆菌的首选底物[12]㊂此外,婴儿双歧杆菌能够产生短链脂肪酸,有利于共生的非致病性细菌的生长,由3个月婴儿的细菌多样性报告[13]显示,其体内的有益双歧杆菌数量定殖增加,而病原菌的定殖数量则在减少㊂HMOs可以作为黏膜表面病原体的诱饵受体,对宿主的健康状况产生影响,同时也可以通过增强肠道屏障功能改善宿主防御机制㊂在HMOs中,2ᶄ-FL可以抑制空肠弯曲杆菌感染以及与其相关的黏膜炎症的发生㊂体外研究表明,2ᶄ-FL能使空肠弯曲杆菌的侵袭力减弱80%,抑制黏膜促炎信号的释放[14]㊂对婴儿进行的一项前瞻性研究表明,2ᶄ-FL的有益作用包括减少与空肠弯曲杆菌相关腹泻的发作次数,对治疗坏死性小肠结肠炎也有良好的疗效[15]㊂同时, LNnT可减少动物模型肺中肺炎链球菌的数量,通过调节肠道微生物菌群来预防坏死性小肠结肠炎㊁念珠菌病和一些免疫相关疾病的发生,从而降低早产儿死亡率和发病率的风险性[16]㊂HMOs的一个重要特性是免疫调节,通过直接调节肠细胞的基因表达,使细胞表面聚糖和其他细胞反应的表达发生变化,调节淋巴细胞因子的产生,使TH1/TH2反应更加平衡[17]㊂对于HMOs来说,它既可以局部作用于黏膜等相关淋巴组织,也可以在全身水平上起作用㊂尤其是2ᶄ-FL,可以通过抑制CD14诱导,直接抑制内毒素介导的肠毒性大肠杆菌侵袭T84和H4肠上皮细胞时的炎症反应,而炎症的抑制作用则激发了HMOs作为天然免疫系统刺激物时所表现出的免疫应答[18]㊂据报道,通过剖腹产出生且食用添加2ᶄ-FL的婴儿配方奶粉的两岁儿童与食用未添加2ᶄ-FL的婴儿配方奶粉的儿童相比,发生与免疫球蛋白E相关的过敏反应的风险更低[19]㊂HMOs及其代谢产物,如唾液酸,在大脑发育㊁神经传递和突触形成中起着重要的作用㊂唾液酸作为大脑最佳发育和认知所必需的营养素,在婴幼儿发育成长过程中的作用不言而喻,HMOs作为唾液酸的来源也显得尤为重要[20]㊂岩藻糖和2ᶄ-FL同时也具有刺激大脑发育的作用,食用2ᶄ-FL可以影响啮齿动物的认知领域,改善学习和记忆能力[21]㊂HMOs中的3ᶄ-SL和6ᶄ-SL也可以通过调节肠 脑轴支持正常的微生物群落和应激期间的行为反应[22]㊂因此采用母乳喂养的婴儿,其大脑发育更加完善㊁神经突触更加丰富㊁神经系统也更加发达㊂2㊀HMOs的分离检测及结构鉴定2.1㊀HMOs的分离检测HMOs的种类繁多,结构复杂,其种类和含量也存在个体差异,不同Lewis血型乳母体内HMOs的种类和含量不同,从而增加了HMOs分离的难度㊂对母乳进行分离,通常需要去除母乳中的脂肪和蛋白质,目前常用的去除脂肪和蛋白质的传统方法[23]有下面几种,一是利用HMOs具有亲水性的特性,通过低温离心去除脂肪,后加入乙醇来沉淀蛋白质;二是可利用分子量大小的不同采用超滤进行分离,HMOs作为小分子亲水性物质可以透过超滤膜,而脂肪和蛋白质是大分子则不能通过;第三种,由于HMOs可溶于乙腈,而脂肪不溶于乙腈,蛋白质则被乙腈沉淀,从而达到分离的目的㊂经过上述处理后,母乳中的脂肪和蛋白质被去除,剩下的物质主要是乳糖和寡糖,需要把高含量的乳糖去除,达到分离HMOs的目的㊂尺寸排阻色谱法作为分离HMOs的传统方法,可以根据分离物的分子大小和形状,按照顺序被洗脱出色谱柱而达到分离的目的㊂但随着分离技术的进步,更高水平的技术层出不穷,固相萃取(solid-phase extraction,SPE)作为样品前处理技术而被广泛应用,具有高通量㊁易自动化㊁操作灵活等优点㊂LEBRILLA团队针对HMOs设计了一个高通量SPE处理流程[24],该流程同时实现了寡糖还原㊁脱盐㊁脱乳糖以及分离中性糖和酸性糖等目标,对样品纯化和粗分离具有良好的效果㊂近些年来,HMOs的研究越来越成为热点,其分离检测也吸引了很多科研人员的关注,越来越多的高水平分离技术应运而生㊂目前常用的分离技术主要有高效阴离子交换色谱(high performance anion ex-change chromatography,HPAEC)㊁亲水作用色谱(hy-drophilic inter action chromatography,HILIC)㊁石墨化碳液相色谱(graphitized carbon liquid chromatography, PGC-LC)㊁毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)等方法㊂HPAEC是根据电荷的不同,在碱性环境下以阴离子形式交换到色谱柱上,与脉冲安培检测器(pulsed ampere detector,PAD)联用,形成HPAEC-PAD,该方法已被广泛应用于HMOs的定性和定量分析,它可以进行寡糖单体的分离分析,尤其是对寡糖异构体有很好的分离效果㊂THURL等[25]使用HPAEC方法研究了不同人群和不同哺乳期寡糖含量的变化情况,对中性和酸性HMOs进行了分析㊂亲水作用色谱作为一种新型的色谱分离技术,克服了正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不足,具有良好的分离选择性和高灵敏度,一般在进行HILIC 分析时,首先会对寡糖进行衍生化处理,来改善峰型㊁分离选择性(尤其是异构体)及检测灵敏度㊂AUSTIN 等[26]利用亲水作用色谱-荧光检测法应用于加标婴儿配方奶粉的检测,效果良好㊂对于石墨化碳液相色谱,可以对寡糖很好地进行保留以及分离,尤其对寡糖异构体能够很好地区分㊂而毛细管电泳可与紫外检测器连用于检测衍生化的HMOs,也可与质谱连用,进行唾液酸化HMOs的分离检测㊂2.2㊀HMOs的结构鉴定糖分子的结构非常复杂,HMOs的结构分析包括单糖组成分析㊁寡糖序列分析㊁岩藻糖和唾液酸修饰位点分析㊂从20世纪80年代开始,有机质谱的发展给糖类化合物的结构分析带来了较大的进展㊂按分析器种类分,目前常应用于HMOs结构分析的质谱有飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometry,TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(Fourier trans-form ion cyclotron resonance mass spectrometry,FTICR-MS),后者较前者来说,分辨效率相对高但是价格昂贵㊂基质辅助激光解析(matrix-assisted laser desorp-tion ionization,MALDI)和电喷雾(electrospray ioniza-tion,ESI)技术的发明,使HMOs的结构解析取得了突破性的进展㊂1994年,STAHL等[27]首先采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法检测了中性和酸性HMOs的组成轮廓,此方法快速准确,且灵敏度高㊁操作方法简便㊂NINONUEVO[28]和LOCASCIO等[29]采用基质辅助激光解析电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FTICR-MS)快速检测了不同样品中的HMOs的组成数量和响应的相对强度㊂电喷雾质谱(ESI-MS)的应用扩展了质谱的质量测定范围,其二级碎片结构还可以提供寡糖的连接顺序和连接键构型信息㊂相对于质谱来说,核磁共振是一种新出现的结构鉴定技术,它的出现给糖类结构解析带来新的发展和进步㊂在进行鉴定分析时不需要标准品即可进行定性分析,这对于HMOs中未知糖的定性分析具有明显优势,但其对样品的纯度要求相对较高㊂随着分离解析技术的进步,质谱和核磁共振技术也经常联合用于寡糖的鉴定分析㊂3㊀HMOs的合成由于自然界天然合成的功能性糖类化合物产量无法满足科学研究和人类生产生活的需求,生产开发功能性糖类化合物已成为科研人员一项挑战性的项目㊂目前,除了从母乳中直接分离HMOs外,体外合成的方法主要有化学合成法和生物合成法㊂下面对体外化学合成和生物合成法作进一步介绍㊂3.1㊀化学合成法1999年ALY等[30]首次用化学方法,经过34步反应合成了LNT及LNnT,但收率仅为0.6%㊂随后SHERMAN等[30]以丙烯基乳糖和乳糖作为原料,将硫苷法引入到LNT衍生物的合成中,由于此合成策略反应步骤多,最终收率也不理想,仅为8.6%㊂固相合成技术把寡糖连接到一个不溶性物质上,如玻璃珠或树脂,实现反应产物和过量反应物快速分离,这一技术被应用于合成已确定结构的寡糖上㊂近些年来,有人提出利用 一锅酶法 ,通过多种酶连续合成寡糖,其基本原理就是通过调控供体和受体的活性,使得两步或者多步糖基化反应连续进行㊂2012年, HSU等[31]以LNnT为底物,利用此法合成的LNFP III 最终得率可达到49.6%㊂2015年,CHEN等[32]从乳糖苷开始,使用一系列激酶㊁异构酶㊁尿苷转移酶和糖基转移酶,通过两步法合成LNnT,得率在81%㊂2016年,ZHAO等[33]同样利用此法合成LNFP I,得率可达到95%㊂用 一锅酶法 合成的产物产率较之前虽有所提高,但仍存在反应步数过多的问题,如合成产物LNFP III就需要10步反应才行㊂而有的产物则无法连续反应,只能分步进行,利用此法产物产率仍然得不到提升㊂化学合成法虽然在合成HMOs方面取得了很大的进展,然而大量有机溶剂的使用㊁严苛的反应条件㊁冗长的反应级数等因素都使得其生产成本昂贵,有毒试剂的存在也限制了HMOs在食品领域的广泛应用㊂3.2㊀生物合成法3.2.1㊀酶法合成由于化学合成HMOs存在自身局限性,为了克服这些缺点,科研人员的研究热点逐渐转移到生物合成上来,生物合成法具有安全无污染㊁运用范围广的特点㊂生物合成HMOs有酶法合成和微生物发酵合成两种途径㊂酶法合成具有立体和化学选择性,对不同底物具有选择特异性㊂酶法合成体现在酶的促进催化作用上,通常表现在底物㊁辅助因子和供体存在下合成的特异性表达㊂用于合成HMOs的特定酶是糖苷酶和糖基转移酶㊂它们可以通过选择性沉淀㊁反复纯化或重组技术从哺乳动物㊁昆虫或微生物这些宿主中获得㊂糖苷酶除了可以定量形成糖苷键外,对糖基供体底物和糖基化寡糖还具有水解作用,它的活性高,且更容易获得㊂但酶体系的稳定较差,生成的产物和底物由于水解作用而难以分离,阻碍了糖苷酶在工业上的应用㊂糖基转移酶具有完全的立体控制和区域控制,底物特异性好,几乎可以定量形成糖苷键,通过将糖基从活化的供体底物转移到受体底物上来催化二糖㊁寡糖或多糖的合成㊂来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的岩藻糖基转移酶使用核苷酸糖鸟嘌呤5ᶄ-二磷酸-β-L-岩藻糖(5ᶄ-diphospho-β-L-fucose,GDP-L-岩藻糖)作为供体,但是对受体乳糖的亲和力较低,特别是来自H.pylori的α-1,3岩藻糖基转移酶(如Fu-tA),这使得2ᶄ-FL或3-FL的生产效率降低㊂但通过截断FutA的C端部分碱基和优化密码子,产率得到了提升[34]㊂另外的α-2,3和α-2,6唾液酸转移酶通过将唾液酸从活化的核苷酸糖供体(如CMPNeu5Ac)转移至受体低聚糖来修饰HMO㊂受体通常以半乳糖苷㊁N-乙酰半乳糖胺或其他唾液酸为终止信号[35]㊂酶法合成虽然有较好的产物收率,但是必需酶的获得并不容易,且糖基转移酶催化需要糖核苷酸作为受体,受体的价格昂贵且不易获得,再加上酶促反应过程中,酶的稳定性㊁催化效率㊁底物和受体的耐受程度等固有属性都会对此法造成影响,使其难以大规模生产㊂3.2.2㊀微生物发酵随着代谢工程和合成生物学的发展,微生物合成途径过程中酶的克隆表达变得越来越广泛,使得全细胞生产的快速发展成为可能㊂微生物合成发酵就是直接在微生物细胞内利用其自身或基因工程过表达或异源表达不同酶进行寡糖合成的一种方法㊂由于HMOs种类和结构不同,所以其合成发酵的方式也有不同之处㊂3.2.2.1㊀岩藻糖基化HMOs岩藻糖基化HMOs是由岩藻糖和乳糖以不同的糖苷键连接而成,以α-1,2糖苷键连接形成2ᶄ-FL,以α-1,3糖苷键连接形成3-FL㊂2ᶄ-FL和3-FL作为HMOs中结构相对简单的低聚糖,在母乳中含量丰富,其中2ᶄ-FL作为HMOs的主要成分而存在,它是由核苷酸糖GDP-L-岩藻糖作为中间供体,在α-1,2岩藻糖基转移酶的作用下,与乳糖进行基团置换而形成的产物㊂3-FL与2ᶄ-FL形成的原理一致,只是由α-1,3岩藻糖基转移酶连接形成㊂关于GDP-L-岩藻糖,它是岩藻糖基化寡糖生物合成途径的关键中间体,主要在岩藻糖基化反应中提供岩藻糖基,其在细菌㊁哺乳动物和植物中有2种合成途径,即从头合成途径与补救合成途径[36]㊂其合成图如图2所示㊂图2㊀GDP-L-岩藻糖的2种生物合成途径Fig.2㊀Biosynthetic ways of GDP-L-fucose㊀㊀目前研究较多的是以大肠杆菌(Escherichia coli)作为模式微生物,E.coli具有代谢产出GDP-L-岩藻糖的2条完整通路(从头合成途径和补救合成途径),通过构建代谢途径中的酶,以重组质粒转化模式生物进行过量表达,从而代谢产出GDP-L-岩藻糖㊂魏万涛等[37]通过克隆表达脆弱拟杆菌(Bacteroides fragi-lis)来源的L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(fucose pyrophosphorylase,Fkp)基因,以L-岩藻糖为底物,通过酶法最终产生GDP-L-岩藻糖的浓度为2.1 mmol/L㊂KOIZUMI等[38]以谷氨酸棒杆菌(Coryne-bacterium glutamicum)产鸟嘌呤-5ᶄ-三磷酸(guanine-5ᶄ-triphosphate,GTP)作为能量,混合E.coli发酵产GDP-L-岩藻糖,其产量达到18.4g/L㊂LEE等[39]在重组E.coli中过表达内源性NADPH再生酶,以期提高GDP-L-岩藻糖的产量,研究表明恒pH值的补料分批发酵中,NADPH再生酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glu-cose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)的过表达使GDP-L-岩藻糖产量增加了21%㊂合成GDP-L-岩藻糖的起始碳源物质有葡萄糖㊁甘油㊁L-岩藻糖㊁甘露糖和乳糖,不同的起始碳源物质对其产量的影响和结果都不同㊂LEE等[40]通过添加甘露糖与以葡萄糖为唯一碳源的情况相比,在过表达gmd和wcaG基因的重组E.coli BL21star(DE3)的补料分批发酵中,甘露糖和葡萄糖的供应导致GDP-L-岩藻糖浓度增加了1.3倍,同时,在葡萄糖限制性补料分批发酵中,一株表达manB㊁manC㊁gmd和wcaG 基因的重组E.coli BL21star(DE3)菌株中,最大GDP-L-岩藻糖浓度比仅表达gmd和wcaG基因的对照菌株高4.4倍㊂BAUMGARTNER等[41]以β-半乳糖苷酶缺陷型(lacZ-)的E.coli JM109为宿主菌,通过构建GDP-L-岩藻糖的从头合成和补救合成通路,以0.2%岩藻糖和甘油为底物,GDP-L-岩藻糖的产量达到0.025g/L㊂乳糖的岩藻糖基化由岩藻糖基转移酶在胞内或胞外催化完成㊂在E.coli JM109(DE3)中表达来源于H.pylori的α-1,2岩藻糖基转移酶基因FutC,通过全细胞催化,其2ᶄ-FL产量只有1.23g/L[42]㊂通过在N端增加3个天冬氨酸标签,使其FutC的酶活力增加,2ᶄ-FL的产量可达6.3g/L[43]㊂在E.coli JM107ΔLacZ中表达H.pylori的α-1,2岩藻糖基转移酶基因FutC和可拉酸操纵子的调控因子rcsA,并敲除可拉酸代谢基因wcaJ,从而构建成产生2ᶄ-FL的菌株,以乳糖为底物,其发酵罐产量可达到14g/L[44]㊂为了增强2ᶄ-FL的产量,通过构建共表达质粒含有2个α-1,2岩藻糖基转移酶基因FutC基因拷贝的菌株以增加酶活,其产量可达20g/L[45]㊂李晨晨等[46]以E.coli BL21star(DE3)为原始菌株,通过敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因lacZ和wcaJ,通过补救途径摇瓶发酵,其2ᶄ-FL产量可达1.44g/L㊂针对3-FL的文献报道中,HUANG等[47]对比不同来源的α-1,3岩藻糖基转移酶,结果表明来源H.pylori的FutA酶获得3-FL产量最高,为12.43 g/L㊂TAN等[48]对3-FL合成酶FutA进行了定向进化研究,通过突变使得突变体的3-FL合成能力提升了14倍㊂3.2.2.2㊀唾液酸化HMOs在唾液酸化的HMOs中,唾液酸乳糖的含量最高,包含3ᶄ-SL和6ᶄ-SL,其浓度可达980nmol/mL㊂唾液酸乳糖主要是以α-2,3或α-2,6糖苷键连接,以唾液酸和乳糖作为前体物质而构成的3ᶄ-SL和6ᶄ-SL㊂首先,胞苷单磷酸-Neu5Ac(CMP-Neu5Ac)合成酶将Neu5Ac催化为CMP-Neu5Ac,其次是α-2,3唾液酸转移酶(α-2,3-PST)和α-2,6唾液酸转移酶(α-2,6-PST)分别催化CMP-Neu5Ac和乳糖生成3ᶄ-SL 和6ᶄ-SL㊂除了体外化学合成外,微生物中也存在CMP-Neu5Ac的从头合成和补救合成途径,其代谢合成途径详见图3㊂FIERFORT等[49]通过共表达来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(neuC)㊁乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)㊁CM-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuA)和来源于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的α-2,3唾液酸转移酶,以E.coli为宿主菌,同时敲除Neu5Ac 醛缩酶㊁ManNAc激酶以及半乳β-糖苷酶的基因,确保代谢通路的通畅,以乳糖为底物生成3ᶄ-SL的产量为25g/L㊂DROUILLARD等[50]采用与生产3ᶄ-SL相似的策略,使6ᶄ-SL的质量浓度达到30g/L㊂此外, GUO等[51]发现多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multoci-da)唾液酸转移酶(PmST)具有双重反唾液酸酶活性,以糖巨肽(cGMP)和乳糖为底物,能够同时催化不同比例的3ᶄ-SL和6ᶄ-SL的形成㊂目前,已经成功开发了以低成本的底物,如甘油和乳糖,有效地合成3ᶄ-SL和6ᶄ-SL的方法㊂但是,YANG等[52]使用低成本的底物葡萄糖进行Neu5Ac的生物合成效率不高,导致最大产量仅为8.31g/L㊂因此,必须从头进行Neu5Ac的生物合成㊂㊀㊀微生物代谢发酵合成HMOs存在代谢产物种类图3㊀CMP-Neu5Ac 的两种生物合成途径Fig.3㊀Biosynthetic ways of CMP-Neu5Ac多㊁难以分离的困难,也存在基因工程改造方面的缺陷,如构建重组质粒时采用抗生素标记基因,限制了其在食品生产中的应用,但随着科学研究的发展,难点被逐渐克服,其已成为目前最有发展潜力的一种技术㊂4㊀展望随着食品健康问题的频发,人们对婴幼儿配方奶粉的成分越来越关注,HMOs 对促进婴幼儿生长发育具有重要的作用,有关HMOs 的科学研究也成为热点㊂目前合成HMOs 的方法有化学法,化学-酶法㊁酶法和微生物发酵法㊂生物合成相对于化学合成来说,由于其条件温和㊁生产成本低㊁环境友好等,越来越受到人们的偏好,但其也存在自身不利的缺陷,目前生物法只能合成结构简单的寡糖,对于复杂的HMOs 合成困难,产量极低,同时也存在分离困难的问题㊂随着科学技术的发展,生物合成的应用前景越来最广泛,越来越多的模式微生物会被发掘利用,从而克服目前技术障碍,用来生产更加安全的产品㊂HMOs 作为益生元对婴幼儿成长可发挥有益的生理作用,结合目前市场上婴幼儿配方奶粉的现状,亟待开发具有不同种类的㊁对婴幼儿健康状况有参考价值的产品㊂参考文献[1]㊀BALLARD O,MORROW A L.Human milk composition:Nutrients and bioactive 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