柑橘溃疡病菌诊断规程

龙源期刊网

湖南省柑橘溃疡病菌gyrB和16S rRNA的扩增和序列分析

作者：

来源：《江苏农业科学》2016年第05期

摘要：为了解湖南省不同地区柑橘溃疡病菌遗传多样性，从湖南省黔阳、祁阳、衡山、道县、茶陵、永兴、沅江、零陵8个柑橘主产区采集样本，分离病原菌，PCR扩增其gyrB基因和16S rRNA序列，阳性样品送样测序。利用生物信息学软件，将测序结果与GenBank中柑橘溃疡病菌相近的黄单胞杆菌构建系统发生树，对比2个不同序列扩增的分辨率。结果表明，gyrB基因比16S rRNA序列分辨率高；利用gyrB基因除了能分析亲缘较近的外源菌株，还能对同属但是生长地区有异的菌株进行更深入的区分。

关键词：柑橘溃疡病；遗传多样性；gyrB基因；16S rRNA

中图分类号： S436.661.1+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0076-03

1912年首次在美国发现[1]，中国相关最早的报道出现在1918年[2]。至今全球已有30多个国家和地区报道发现了该病害，占世界柑橘种植国家和地区的50%以上[3-4]。柑橘溃疡病对我国柑橘产业有较大影响，不仅降低了全国柑橘产量和品质，还制约了我国柑橘产业的发展[5]；其中发病严重的地区包括湖南、福建、广东、广西等。柑橘溃疡病是一种细菌性病害，病原菌为地毯草黄单胞柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri），病菌主要通过自然孔口和伤口感染健康植株。该病菌在叶、枝梢及果实的病斑中越冬，翌年春条件适宜时从病部溢出，借风雨、昆虫传播，经寄主的气孔、皮孔和伤口侵入，使叶片、嫩梢和果实发病[6]。叶片受害，开始在叶背产生针头大小的黄色、油渍状小点，后逐渐扩大。同时，在叶片正反两面逐渐隆起成圆形病斑，病部表皮破裂，病斑木栓化如海绵状，表面粗糙，灰褐色。其后中央凹陷并有细微轮纹，周围有黄色晕圈，在晕圈的内侧常有褐色釉光边缘，后期病斑中心开裂并且凹陷，呈火山口状。柑橘溃疡病自然条件下传播距离较近，主要途径是风雨、虫害和农作时造成的伤口以及植株间摩擦等[7]。

一、发病图片

二、症状描述

主要为害叶片、果实和枝梢。叶片染病，初在叶背产生黄色或暗黄绿色油渍状小斑点，后叶面隆起，呈米黄色海绵状物。后隆起部破碎呈木栓状或病部凹陷，形成褶皱。后期病斑淡褐色，中央灰白色，并在病健部交界处形成一圈褐色釉光。凹陷部常破裂呈放射状。果实染病，与叶片上症状相似。病斑只限于在果皮上,发生严重时会引起早期落果。枝梢染病，初生圆形水渍状小点,暗绿色，后扩大灰褐色，木栓化，形成大而深的裂口，最后数个病斑融合形成黄褐色不规则形大斑，边缘明显。

三、发病特点

病菌在病叶、病枝或病果内越冬，翌春遇水从病部溢出，通过雨水、昆虫、苗木、接穗和果实进行传播，从寄主气孔、皮孔或伤口侵入。病菌有潜伏侵染性，有的柑橘外观健康却有病菌侵染，有的柑橘秋梢受侵染，冬季不显症状，春季才显症状。从3月下旬至12月病害均可发生，一年可发生3个高峰期。春梢发病高峰期在5月上旬，夏梢发病高峰期在6月下旬，秋梢发病高峰期在9月下旬，其中以6、7月份夏梢和晚夏梢受害最重。气温在25～30℃条件下，雨量越多，病害越重。暴风雨和台风过后，易发病。潜叶蛾、恶性食叶害虫、凤蝶等幼虫及台风不仅是病害的传病媒介，而且其造成的伤口，有利于病菌侵染，加重病害的发生。栽培管理不当，如氮肥过多、品种混栽、夏梢控制不当，有利发病。

四、

防治方案

1、萌芽前喷雾（3月初）

方案：《溃腐灵》100-200倍喷雾一次

作用：杀灭病菌并为春芽萌动提供养分，有利于防治多种真细菌病害；

2、花期、展叶期喷雾（3月中旬至5月下旬）

方案：《靓果安》300倍+《沃丰素》600倍喷雾分别在3月中旬、4月上旬、4月下旬喷雾。

作用：杀灭潜藏、繁殖的病菌，促进展叶，预防多种真细菌病害（树脂病、煤污病、溃疡病、疮痂病）。

3、谢花期（5月中旬）

方案：《靓果安》300倍+《沃丰素》600倍喷雾一次

作用：广谱杀菌、减少菌源，巩固预防效果，在复壮基础上使果皮密实、油细胞小，减少沙皮果与日灼危害。

收稿日期:２０１９－０４－２４ 修回日期:２０１９－０６－１２基金项目:国家自然科学基金项目(３１６７１９８８、３１８７２９１９).作者简介:徐鑫焱(１９９８－)ꎬ女.研究方向:植物病理学.Ｅｍａｉｌ:１０５５４３１３９７＠ｑｑ.ｃｏｍ.通信作者邹华松(１９７２－)ꎬ男.研究员ꎬ博士.研究方向:植物病理学.Ｅｍａｉｌ:ｈｓｚｏｕ＠ｆａｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎ.柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

徐鑫焱ꎬ李艳娇ꎬ户　勋ꎬ邹华松(福建农林大学植物保护学院闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室ꎬ福建福州３５０００２)

摘要:采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Ｘｃｃ)中国菌株Ｘｃｃ２９￣１中鉴定出６个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将６个编码基因全部敲除ꎬ得到胞外蛋白水解酶缺失突变体ꎬ对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示ꎬ蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱ꎬ并且附着到试管壁的细菌数量显著减少ꎬ形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后ꎬ形成的溃疡病斑水渍状程度加大ꎬ在柑橘中的繁殖速度变快ꎻ在柑橘叶片中ꎬ６个胞外

开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ)蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Ｘｃｃ的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.关键词:柑橘黄单胞柑橘亚种ꎻ胞外蛋白水解酶ꎻ致病力ꎻ生物膜中图分类号:Ｓ５７１.１文献标识码:Ａ文章编号:１６７１￣５４７０(２０２０)０１￣０００１￣０９ＤＯＩ:１０.１３３２３/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊ.ｆａｆｕ(ｎａｔ.ｓｃｉ.).２０２０.０１.００１

ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅａｓｅｏｎｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉｓｕｂｓｐ.ｃｉｔｒｉ

ＸＵＸｉｎｙａｎꎬＬＩＹａｎｊｉａｏꎬＨＵＸｕｎꎬＺＯＵＨｕａｓｏｎｇ

(ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＰｅｓｔＣｏｎｔｒｏｌｆｏｒＦｕｊｉａｎａｎｄＴａｉｗａｎＣｒｏｐｓꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａ)

—30—试验研究2019年第1期总第172期—31—试验研究2019年第1期总第172

期

Ｌ待试细菌菌液加入到

离心管内，然后加入2

L加入培养基，整个过程在无菌条件下操作。

柑橘溃疡病原细菌采用SPA液体培养基28℃摇

床上震荡培养16h以上；其它三种菌采用LB液

体培养基37℃震荡培养培养16h以上，用分光光

度计（7200型分光光度计，Biophotometerplus6132，

产自德国）在600nm波长下测定培养液的吸光度

来评价药剂的抑菌效果。其中，为进一步简化操

作步骤，将该方法可简化为直接观察菌液浑浊度

来判断药剂的抑菌效果。

选取其中具有抑制作用的药剂作进一步的稀

释浓度和药效持久性分析：取灭菌1.5mL离心管，

将药剂加入液体培养基使其终浓度分别为1000

倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍和32000

倍六个浓度梯度的稀释，每个离心管中加入等量2—32—试验研究2019年第1期总第172

期

Ｌ涂

平板观察，观察相应平板上形成的单菌落数，计

算菌液浓度（表3）。结果显示，浑浊度或吸光值

与菌落生长数呈直线正相关,即菌液越浑浊或吸

光值越高，形成的菌落越多。在Excel2003软件

内绘制吸光值与菌落浓度的工作曲线图（图1），

得出吸光值（

１００％

抑制率（

１００％—33—试验研究2019年第1期总第172

期

图1柑橘溃疡细菌菌液浓度与吸光值关系曲线Fig.1Relationcurveofthecolonynumberofcitruscankerbac-teriumandtheabsorbancevalueoftheculturedbacterialliquids

2.2柑橘溃疡病菌防治药剂的室内药效评价

2.2.135种药剂的初步室内毒力测定分析

采用所述方法对以下药剂进行了室内毒力

测定分析。药剂除注明稀释倍数外均为500倍

稀释，为了简化测定的步骤，以下毒力测定实验

中采用直接观察的方法。结果显示，除甲壳素、

壳聚糖、甲壳素和壳聚糖聚合物、见菌杀、金碘、