双酶切体系

双酶切概述

双酶切反应 (Double Digests)

1、同步双酶切

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

2、分步酶切

如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

双酶切建议缓冲液

注：

只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。

注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。

某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。

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双酶切的注意事项

1、 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。

实验准备及操作流程图 胡建和

22-4-27

EcoR I酶切鉴定

组分 体系

质粒DNA 3µl

水 4µl

buffer 1.5µl

BSA 0.5µl

EcoR I 1µl

10µl体系，于水浴中切割3小时，然后电泳，点样5µl。通常质粒DNA出现三个条带，由前到后的顺序为闭环质粒、线性质粒和开环质粒。

BamH I和Hind III双酶切体系鉴定

使用pMD-18T载体连接的目的片段，酶切鉴定时选用BamH I和Hind III双酶切体系鉴定：（见下表）

依DNA量定体系 5µl 10µl 10µl＊ 10µl

重组DNA 2 6.5 3 4

BSA 0.3 0.5 0.2 －

BamH I 0.4 1 0.5 0.5

Hind III 0.4 1 0.5 0.5

Buffer（10×） 0.5 1 1 1

H2O 1.4 － 4.8 4

反应条件 37℃水浴，3hr，电泳检测

若质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清时注意得不够，可用酚:氯仿对solution进行抽提，以去除少量制备中的杂质，若问题依然存在，可用离心，柱层析纯化DNA。

Xbal I和Sal I双酶切体系鉴定

依DNA量定体系 20µl 10µl 10µl

灭菌去离子水 8.5 4.3 －

10×buffer 2 1

1

BSA(10µg/µl) 0.2 0.1 0.1

DNA(1µg/µl) 8.3 4 7.9

Xba I(10U/µl) 0.5 0.3 0.5

Sal I(10U/µl) 0.5 0.3 0.5

反应条件 37℃，1~3hr，电泳检测

Hind III单酶切

依DNA量定体系 30µl

灭菌去离子水 4

10×buffer 3

DNA(1µg/µl) 20

Hind III 3

反应条件 37℃，1~3hr，电泳检测

NotI和Sal I双酶切体系鉴定

双酶切反应

反应体系：

试剂名称 加入体积（μL /10μL）

质粒 2

10×Fast Digest Green Buffer 1

BamHI 0.5

KpnI 0.5

ddH2O 6

反应参数：

温度（℃） 时间（min）

37 30

80 10

酶切操作技巧

实验材料

实验耗材：枪头（10μl、200μl）、EP管(200μl)

试剂：限制性内切酶及buffer、ddH2O

准备工作：

冰，37˚C水浴、质粒或PCR产物

实验操作步骤：

酶切反应体系

成分 体积（µL）

质粒或PCR产物 <1µg

Buffer 2

限制性内切酶1 1

限制性内切酶2 1

ddH2O Up to 20

37˚C水浴2h。

注意事项：

1. 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer里的效率。

2. 双酶切时间及其体系：一般酶切2个小时，酶切效率低的可适当延长时间，酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ug DNA。

3. 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

4. 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。

5. 酶量的问题：不同公司的酶活力单位不同，按说明书的酶切体系添加酶量，按反应条件进行酶切反应。