核苷酸测定方法研究进展
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核苷酸测定方法研究进展
王添琦;吴海棠;王慧;谭光国;娄子洋
【摘 要】A review on the methods for pre-treatment and determination of
nueleotides including MS, chromatography-MS and electrocapillary-MS, as
well as the principles, specific features and drawbacks of the respective
methods mentioned above was reported in this paper covering mainly the
years from 1993--2010 (39 ref. cited).%对应用于核苷酸的前处理方法和测定方法，包括质谱法、色谱-质谱联用法、毛细管电泳-质谱法等的现状（主要在1993-2010年间发表的文献）及相关的原理、方法的特点及不足之处作了综述（引用文献39篇）。
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2012(048)009
【总页数】4页(P1119-1122)
【关键词】核苷酸;前处理方法;测定方法;综述
【作 者】王添琦;吴海棠;王慧;谭光国;娄子洋
【作者单位】第二军医大学药学院,上海200433;第二军医大学药学院,上海200433;第二军医大学药学院,上海200433;第二军医大学药学院,上海200433;第二军医大学药学院,上海200433
【正文语种】中 文
【中图分类】O65 核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多生理功能，可作为脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）的前体，也可作为生理、生化过程的调节物质参与体内物质代谢。目前，国内外测定核苷酸的方法主要有离子交换液相色谱法、反相液相色谱法、亲水色谱法和毛细管电泳法等。其中，离子交换色谱法具有较高的分离效率，但需要对分离柱进行平衡（再生），分析时间较长；反相液相色谱法，具有快速、操作方便的优点；毛细管电泳技术以其快速、高效、污染小等特点发展迅速，已应用到核苷酸的测定中。本文综述了近几年来核苷酸分析方法的研究进展，在分析其各自原理的基础上，主要对比了它们在应用方面的优缺点。
对于生物样品的测定，前处理步骤是至关重要的，它决定了测定结果是否准确可靠。通常前处理技术包括淬灭和代谢物的提取两步。淬灭就是通过快速抑制酶活性，使代谢反应停止。由于核苷酸含量会随着环境的改变或者转化在几秒内发生剧烈的变化，所以要采取有效的淬灭方法快速抑制酶的活性从而准确地测定其含量。常用的淬灭方法是快速加入冷的缓冲溶液或有机溶剂淬灭，如应用预冷的－40℃的甲醇－水（6＋4）溶液作为淬灭试剂［1］。
样品淬灭后，需尽快对样品中代谢物进行提取。可以通过采用高温、较高的酸度、有机溶剂、机械压力等方法进行代谢物的提取，采用高氯酸［2］、热水［3］和热乙醇［4］等提取核苷酸类、葡萄糖类、有机酸类和氨基酸类等成分的方法早有应用；文献［5］报道用热水、热乙醇、氯仿－甲醇、甲醇中冻融循环和酸性乙腈－甲醇等5种提取方法对啤酒酵母中的44种代谢产物（包括核苷酸类）进行提取，结果表明：热乙醇和氯仿－甲醇是较好的提取剂，它们的回收率约为100%，且重现性好。理想的提取方法必须满足完整提取、确保酶的失活和防止代谢产物的转化及其本身的降解。就上述而言，在用特定代谢产物的回收因子［6］或通过使用合适内标［7］的情况下，部分产物的泄漏是可以接受的。另外，固相萃取技术作为前处理的新方法也被越来越多地应用于样品的纯化和目标产物的富集，如大肠杆菌细胞中对核苷酸的分离，利用了SAMPLIQ C18固相萃取柱和SAMPLIQ WAX 固相萃取柱［8］。
质谱法（MS）是通过测定样品离子的质荷比（m／z）来进行结构分析和含量测定。随着20世纪80年代两种软电离方式——基质辅助激光解吸附电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）的出现，使得质谱法能用于分析高极性、难挥发和热不稳定的生物样品。通过对生物样品分子进行轰击获得多个碎片离子，根据其质荷比进行定性或定量分析。质谱法是唯一可以给出相对分子质量，确定分子式的方法，而分子式的确定对化合物的结构鉴定至关重要。
De Bellis等［9］利用2－丙醇作为洗脱剂，以精脒（或三乙胺）为DNA的修饰剂采用直接进样－ESIMS成功地测定了200个相对分子质量为5～15kU（17～51mer）的合成寡核苷酸。与ESI－MS相比，MALDI－MS更适用于分析相对分子质量大的寡核苷酸。另外，质谱法也可用于样品的定性和定量分析。不同的寡核苷酸相对分子质量不同，在质谱图中以不同的峰出现，同时目标物含量与峰面积之间存在正比关系，通过建立标准曲线可实现目标物的定量测定。Ding等［10］采用 MALDI－MS实现了对不同寡核苷酸的定量。通过改变基质及样品与基质用量的配比来降低检出限。
核苷酸是一类含有磷酸基团的化合物，它们具有低挥发性和热稳定性的特点，不宜通过气相色谱分离，因此现在很多研究关注于液相色谱联用技术。
2.2.1 离子对色谱法
目前常用的离子对色谱法主要为反相离子对色谱法，选用的固定相绝大部分是化学键合型的非极性表面固定剂。反相离子对色谱法被认为是离子色谱和反相色谱的扩展和延伸，它的操作流程和基本设备与常规反相色谱法相同，常与紫外检测器串联后用于核苷酸的测定［11－12］。离子对色谱法与常规色谱法的不同在于流动相中加入离子对试剂，离子对试剂的种类按分离物性质可以分为两类：分离酸性或带负电物质用季铵盐；分离碱性或带正电物质用烷基磺酸盐。常用的挥发性离子对试剂有氢氧化四丁基铵（TBAH）和七氟丁酸（HFBA）等。
有文献报道在反相色谱流动相中加入铵离子对试剂，可有效分离包括核苷酸类、磷酸糖类和羧酸类等在内的大量带负电荷的代谢物［13－16］。这些方法利用了三丁胺和己胺等挥发性阳离子化合物与带负电荷分析物形成离子对，从而增强了其在C18柱上的保留能力而进行分离的。Miller等［17］利用高效液相色谱紫外（HPLC－UV）系统，以四丁基硫氰酸铵（TBAHS）为离子对试剂，对细菌代谢液中的多种核苷酸（AMP、ADP、ATP、CMP、CDP、CTP、GMP、GDP、GCP）等成分进行了测定。
虽然离子对色谱法广泛用于带电荷化合物（如核苷酸）的分离，但是对于一些不易挥发的盐类试剂会污染质谱仪而应用受限。目前，更多使用了挥发性离子对试剂的HPLC－MS已经成功地用于核苷酸类的分析［18－23］。
2.2.2 离子交换色谱法
离子交换色谱法也常用于核苷酸及核苷酸糖的分析［24－26］。由于其必要的高盐浓度而阻碍了在ESI源上的应用，当使用pH梯度洗脱方法来替代高浓度盐的使用时，离子交换色谱法即可与质谱法联用［27］。离子交换色谱法的基本原理是利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离的。核苷酸类属于带负电荷的物质，应用阴离子交换色谱进行分离和定量。离子交换色谱法具有较高的分离效率，但需对分离柱进行平衡、再生，耗时长。
Bhattacharya等［28］用基于阴离子交换色谱柱的液相色谱紫外（LC－UV）串联系统对大肠杆菌细胞内27种负电荷的代谢中间体（包括7种核苷酸类）进行定量分析，方法可用于评估细胞内的磷酸戊糖代谢路径和三羧酸循环情况。
李 意［29］ 利 用 Shim－Pack WAX－1 色 谱 柱 的HPLC－UV系统对小球藻提取物中的 AMP、5′－dAMP、CMP、5′－dCMP、GMP、UMP 和 5′－dGMP进行定量。该方法简便、灵敏度高、重现性好，为研究和开发小球藻类生物有效物质的核苷酸检测提供了较好的方法。
2.2.3 亲水作用色谱法
亲水作用色谱法（HILIC）是一种以极性固定相（如硅胶或衍生硅胶）及含极性有机溶剂和水溶液为流动相的色谱模式，流动相的有机部分是弱洗脱剂，水溶液是强洗脱剂。化合物按亲水性增加的顺序流出。近来该技术已被成功地应用于生物样品中极性化合物（包括核苷酸类）及其代谢产物的分离和鉴定［30］。虽然对于分离亲水性代谢产物给予很大希望，但对于相对分子质量相近的核苷酸糖的分离仍是个挑战。
Bajad等［31］使用 LC－ESI－MS／MS方法，利用三重四极杆串联质谱，以N－乙酰基谷氨酰胺作为内标，对141种大肠杆菌细胞的水溶性代谢产物进行了分离并定性，其中包括29种核苷酸类（如AMP、CMP、dCMP、GMP、UMP、ADP、ATP等）。试验比较了反相柱、亲水柱、多孔石墨碳柱等7种不同的色谱柱，结果表明：HILIC氨基丙基柱在pH 9时的分离效果最好。文献［8］报道，用两个相同的ZIC－pHILIC柱串联的LC－UV系统可将大肠杆菌代谢液中8种三磷酸核苷酸进行分离。同时考察了色谱柱固定相的种类、流动相的比例、色谱柱的串联以及柱温对于分离效果的影响。结果表明：使用两根相同HILIC柱串联时明显提高色谱的分离能力。
2.2.4 以多孔石墨化碳作为固定相的反相色谱法
多孔石墨化碳是一种独特的固定相结构，其中碳原子以平面六边形结构紧密结合，形成大分子的多环芳香族化合物。多孔石墨化碳与传统的硅胶键合固定相相比，在结构和保留性上都不相同，pH值在0～14条件下都稳定，能使极性很强的物质得到理想保留并分离。目前已经广泛应用于核苷酸的分离［32－33］。Pabst等［34］基于 hypercarb 柱的 LC－ESIMS系统对植物和哺乳动物细胞提取液中超过40种核苷酸类和核苷酸糖类进行良好地分离。文章还指出，新的PGC色谱柱在试验前要进行还原剂处理，同理，对于使用几年以上的PGC柱要用四氢呋喃和盐酸进行处理，最后再用还原剂处理2h。处理后的PGC柱对核苷酸及核苷酸糖的保留会加强，但是在几百次的生物样品进样后柱子的亲和力也会发生不可逆的减弱。
毛细管电泳以高压电场为驱动力，在毛细管中阳离子、中性分子、阴离子按其分配系数的差异而实现分离。相对于液相色谱，毛细管电泳有利于分离极性和结构相似的化合物，具有柱效高、分析时间短、进样量少的优势。毛细管电泳与ESI－MS［35］或与UV［36］检测器串联可用于核苷酸类、核苷酸糖类的分离。
由于核苷酸在pH 2～12范围内带有负电荷，因此，可以使用电泳技术分离。影响核苷酸分离的主要因素为电泳介质的浓度和pH值。pH值通过改变核苷酸的电离度、质荷比从而影响电泳速率及分离效果。核苷酸的分离采用碱性的缓冲溶液，这是由于碱性溶剂提供稳定的电渗流，可替代涂层的毛细管。
赵星洁等［37］采用毛细管区带电泳法，以磷酸氢二钠溶液作为缓冲溶液，实现了降解啤酒废酵母中的RNA所得的胞嘧啶核苷酸（CMP）、脲嘧啶核苷酸（UMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）及鸟嘌呤核苷酸（GMP）等4种5′－核苷酸的分离，并讨论了试验中缓冲溶液种类、浓度、pH值的影响。其中，缓冲溶液浓度的变化将引起毛细管内壁与溶液间双电层厚度和电渗流大小的改变。缓冲溶液的pH值对于等电点相近物质的分离和易发生变性物质的分离具有较大影响。当缓冲溶液pH值小于9.0或大于10.0时，4种核苷酸均会发生变性，且随pH值增加分离度增加，迁移时间明显延长。作者还考察了分离电压和温度对分离的影响。文献［38］提出了一种使用压力协助的毛细管电泳与质谱串联（PACE－MS）对核苷酸及辅酶进行测定的方法，使用普通键合硅胶的毛细管柱，并用磷酸盐对硅醇基涂层有效地防止核苷酸与毛细管壁作用；并对缓冲溶液的pH值进行了优化。在前处理过程中，需要关闭电喷雾源，以避免磷酸盐对质谱检测器的污染。核苷酸在电
