核酸的鉴定方法(一)

核酸的定性分析

【目的】

1 ．掌握测定核酸 的组成从而 定性分析 DNA 或 RNA 的方法。

2 ．熟悉测定核酸的组成从而定性分析 DNA 或 RNA 的 原理。

【原理】

RNA 和 DNA 均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（ RNA 中的核糖与 DNA 中的脱氧核糖）和磷酸。水解产物可用下列方法鉴定。

1 ．嘌呤碱的鉴定原理

嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。

2 ．核糖的鉴定原理

核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与 3 ， 5- 二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。该反应需三氯化铁作为催化剂。

3 ．脱氧核糖的鉴定原理

脱氧核糖在浓酸中脱水生成 ω- 羟基 γ- 酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。

4 ．磷酸的鉴定原理

定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。

【器材】

1 ． 试管与滴管

2 ． PH 试纸

3 ． 沸水浴

4 ． 带有长玻璃管的胶塞

【试剂】

1 ． 5% 硫酸

2 ． 5% 硝酸银溶液

3 ．浓氨水

4 ． 3,5- 二羟甲苯试剂

取 FeCl 3 ·6H 2 O 1.0g 溶于 6ml 水中，加浓盐酸 100ml ，混匀，此为 A 液。另配制 6%3,5- 二羟甲苯乙醇溶液为 B 液。临用时用 A 液 100ml 加 B 液

3.5ml 混合即可。

5 ．二苯胺试剂 取二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰乙酸中，加浓硫酸 2.75ml 。此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。

6 ．钼酸试剂

取钼酸铵 2.5g 溶于 20ml 水中，加浓硫酸（ A·R ） 8.5ml, 冷却后再加水至

100ml ，放冷处可保存 4 周左右。

动物组织中核酸的提取与组分的鉴定

[适用对象] 药学、药物制剂、中药学、中药学（国际交流方向）、制药工程、中药学（知识

产权保护方向）、生物工程专业

[实验学时] 4学时 一、实验目的

掌握核酸分离的方法及各成分的鉴定，熟悉台式离心机的使用，

并学会小鼠的处死。 二、实验原理

组织细胞中的核酸大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。核蛋白被

三氯醋酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的钠盐，再加入乙醇可

使核酸钠沉淀析出。

核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）均可被硫酸水解产

生磷酸、碱基（嘌呤和嘧啶）和戊糖（RNA含核糖，DNA含脱氧核

糖）。此三类化合物可用下述方法鉴定之。 1、磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，后者在还原剂氨萘酚磺酸作

用下形成蓝色的钼蓝。 2、嘌呤与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。

3、核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯

缩合而成绿色化合物。 4、脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟（基）-γ-酮（基）戊醛，它与

二苯胺作用生成蓝色化合物。 三、仪器设备

台式离心机 四、相关知识点 核酸组成知识；化学呈色反应知识；离心技术知识。 五、实验步骤

（一）制备匀浆 将小白鼠1只，拉断脊椎致死，剖腹取出全部

肚组织；用清水冲净血污后，用滤纸吸干，用剪刀剪碎，再加0.9%NaCl

溶液2ml于研钵中制成匀浆。

（二）分离提取 取全部匀浆于离心管（或小试管）内，加2%

三氯醋酸2ml，用玻璃顶替搅匀，静置3分钟，3000转/分离心3分

钟。3000转/分离心3分钟。弃上清液，于沉淀中加入10%NaCl2ml，

充分混匀；置沸水浴中加热8分钟，用玻璃顶替边加热边搅拌（防止

玻管底破裂），使之充分生成核酸钠化合物。取出放冷，3000转/分离

心3分钟。将上清液倒入另一试管内，逐滴加入95%冷乙醇2ml，边

加边搅拌，待析出白色沉淀。静止5分钟后，再3000转/分离心5分

钟，倾去上清液后沉淀备用。

（三）核酸水解 于上述白色沉淀（核酸钠）中加入5%H2SO4

HSV-1碱性核酸酶AN在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

碱性脱氧核糖核酸酶(alkaline deoxyribonuclease,AN)由HSV-1的ul12基因编码,在碱性条件下同时拥有核酸外切酶活性和核酸内切酶活性,理论分子量为68.3kD,AN是HSV-1的复制关键酶。对细胞感染UL12无效突变体的子代病毒产量的分析表明了UL12在衣壳化之前参与识别HSV-1复制中间体分支结构,这些发现表明AN能成为抗疱疹病毒的一种新靶点。

前期我们克隆了HSV-1 SM44株(来自中国生物制品检验所)的ul12基因,构建了原核重组表达质粒pET32a-UL12,表达产物AN在大肠杆菌BL21中以包涵体形式存在,对其进行溶解、复性和活性检测,虽然得到有核酸酶活性的蛋白,但复性困难和蛋白收率降低,不利于AN的大规模制备,使AN的进一步应用受到了限制。目的用毕赤酵母系统表达AN,以便得到足量、可溶的活性蛋白AN。

方法1.目的基因ul12-2的合成:NCBI上查阅目的基因ul12-2 HSV-1国际标准株17株的序列,在不改变其氨基酸序列的前提下,利用软件对密码子进行优化,选择毕赤酵母表达偏好的密码子,设计一条新的基因序列ul12-2,在基因两端分别引入酶切位点EcoR I和Not I,同时加入含6个组氨酸的His-tag,基因全长1913bp,由上海瑞楚生物科技有限公司合成。2.真核表达载体pPIC9K-UL12-2的构建:将ul12-2基因序列经EcoR I和Not I双酶切后,与同样经过EcoR I和Not

I双酶切的酵母表达载体pPIC9K进行连接,转化DH5α,提取质粒pPIC9K-UL12-2。

3.筛选毕赤酵母pPIC9K-UL12-2重组子:参照文献[1]利用Sal I酶对重组质粒pPIC9K-UL12-2进行线性化,然后电转化整合入毕赤酵母菌GS115,在组氨酸缺陷平板上筛选转化子。通过G418抗性筛选及分析表型得到最利于外源基因表达的重组子。 4.在摇瓶上诱导表达an:对筛选出的重组子分别在锥形瓶里诱导表达。诱导方法参照文献[2]做了改进,挑取单菌落接种至10mlbmgy培养基中,于28℃,250-300r/min振荡培养过夜至od600为6左右;室温1500g/min离心收集菌体,用bmmy培养基重悬菌体,使od600在15-60之间,将菌液移入新的摇瓶继续振荡培养;每12h向培养基中补充一次甲醇至终浓度为0.5%,间隔24h取样一次,离心收集上清液,表达产物采用sds-page进行检测。

2021年-2022年最新

1 编号：3-1

主题：Luciferase报告基因系统

概述：

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

原理简述如下:

(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

(2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

(3) 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

目的： 2021年-2022年最新

2 检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用

步骤：

使用 Promega公司的Dual-luciferase Reporter Assay System进行检测:

1)取对数生长期的目的细胞，接种于24孔培养板中，继续培养16~24h,待细胞汇片至70~80%时进行转染；

2) 将Luciferase报告基因质粒、Renilla对照质粒及其它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞。每组设3个平行孔，37°C，5%CO2条件下培养24h；

3)弃去培养基，用冰预冷的PBS洗2次，以除去残余培养基。每孔细胞加入100