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实验一牛乳中细菌的检查一、目的要求1．了解牛乳的细菌学检查方法——显微镜直接计数法和标准平板计数法。
2．学习牛乳的巴斯德消毒法。
二、基本原理从健康母牛体内刚挤出的牛乳，含有少量的正常起始微生物。
生牛乳是一种流体,富含糖类,蛋白质,脂肪,无机盐和维生素等营养物质,其中的细菌会很快繁殖,因此,采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查,比较得出最佳检测方法,确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
但将牛乳装入未消毒的器具和在分装、运输过程中，会被很多其他微生物甚至致病菌污染，而且牛乳含有丰富的营养物质（碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等），在其中的微生物，会很快生长繁殖，因此，一份牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状况和牛乳生产与保藏的条件。
显微镜直接计数法适用于含有大量细菌的牛乳，生牛乳可用此法检查。
标准平板计数法是广泛用于牛乳微生物计数的常规方法，此法比较敏感，牛乳中含少量细菌时，能得出比较正确的结果。
三、器材及试剂生牛乳10ml，灭菌水，肉膏蛋白胨琼脂；灭菌培养皿，1ml与10ml灭菌吸管，灭菌试管，微量吸液器与吸嘴各一个，载玻片，美蓝染液，烧杯，显微镜，水浴锅，试管架，吸水纸等。
四、操作步骤1．显微镜直接计数（1）在白纸上画出1cm2的方块，然后载玻片放在纸上。
（2）用10μl的微量吸液器吸取混匀了的生牛乳样品，放在载玻片 1cm2区域的中央。
（3）用接种针将牛乳涂匀，并涂满1cm2的范围。
（4）使涂片于空气中慢慢干燥。
将铁丝试管架放在沸水浴中，然后置已干燥的涂片于试管架上，用蒸汽热固定5分钟，待干。
（5）浸于美蓝染液烧杯内染色2分钟。
（6）取出载玻片，用吸水纸吸去多余的染料，晾干。
（7）再用水缓缓冲洗，晾干。
（8）油镜下观察细菌数，共数30—50个视野。
（9）计算细菌的数目2．巴斯德法消毒牛乳(1)将水浴锅的温度调节到63℃。
(2)将生牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布。
牛乳中的微生物群落研究近年来，微生物群落的研究备受关注，它涉及到各种领域的研究，包括食品科学领域。
牛奶是日常生活中不可或缺的重要食品，其中微生物群落如何影响牛奶的质量和健康价值备受关注。
牛乳中微生物群落的研究对于优化乳制品生产和保障消费者健康具有重要价值。
一、牛乳中的微生物群落概述牛乳中的微生物可以分为两大类：有益微生物和有害微生物。
有益微生物包括乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌等，它们可以促进牛奶中乳糖的转化，产生对人体有益的乳酸、乳酸盐和其他有机酸等物质。
有害微生物包括大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等，如果牛乳中这些微生物数量过多，会导致牛奶的质量下降，对人体健康产生危害。
二、微生物群落对牛乳质量的影响微生物群落对牛乳的质量和营养成分的影响十分重要。
正常情况下，牛奶中的乳酸菌数量越多，奶质越纯，口感和营养价值就越高。
相反，如果牛奶中的有害微生物和腐败细菌数量增多，牛奶的口感和营养价值就会下降，带来负面影响。
此外，不同地区和季节对微生物群落的影响也不同。
研究表明，不同季节的牛奶微生物群落差异较大，夏季的牛奶中有更多的有害微生物和腐败细菌。
三、牛乳中微生物群落的研究方法对牛乳中微生物群落的研究可以采用传统培养方法和分子生物学方法。
传统培养方法是指将样本涂抹在培养基上，培养并筛选微生物形态、生理生化特性等。
分子生物学方法是指利用DNA序列差异，通过PCR、DGGE、T-RFLP等技术对微生物群落进行分析。
传统培养方法具有简单、成本低的优点，但是因为有些菌株难以培养、生存时间较短或存在恶劣环境适应性等问题，有时不能准确判断微生物群落的多样性和复杂性。
分子生物学方法则能够在短时间内鉴定、定量、分离和鉴定微生物群落，但是花费高昂而且需要复杂的实验操作。
四、微生物群落研究对牛乳加工和质量管控的意义微生物群落研究对于保证牛奶的质量和卫生具有重要意义。
如何控制牛乳中的微生物群落，对于牛奶的加工处理和质量管控是一个重大问题。
牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法-养牛技术嗜冷菌在-15—20℃之间最宜生长，其在保存过程中产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，所以在高温杀菌后仍有残留，从而造成牛奶腐败变质。
为避免鲜牛乳发生变质,一般从收集到加工过程中都采取冷藏,但此时往往会导致乳中嗜冷菌占具主导地位,而其产生的耐热性酶类是主要造成鲜牛乳以及乳制品质量变差的一个主要原因.检测牛乳中细菌总数一般在37℃温度下进行48h培养,但该条件下嗜冷菌不会生长,从而往往被忽视,应加强检测。
下面就具体来了解一下：牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法。
1、来源鲜牛乳中的嗜冷菌具有比较广泛的来源，且可分成较多类型的菌株，其中数量较多的是微球菌、假单胞菌以及产碱杆菌。
微球菌分布比较广泛，主要存在于动物体表、空气、水源以及、设备上；假单胞菌属主要在海水、淡水、土壤以及多种植物体内存在；产碱杆菌主要在饲料、水源以及粪便中存在。
在污染嗜冷菌的途径中，主要是通过接触个人，如药浴杯污染、挤奶工双手不卫生、水清洗乳头污染、贮存及运输设备不干净或没有严格消毒等，都容易导致嗜冷菌含量过高。
2、危害鲜牛乳中主要为兼性嗜冷菌，产碱杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、黄杆菌属以及无色杆属等，是目前经常能够分离到的嗜冷菌。
通过对以上菌株进行特性分析，发现其都会影响鲜牛乳的保存。
例如，假单胞菌具有很强分解蛋白质和脂肪的能力，能够导致脂肪发生分解，从而容易形成脂肪哈败味，还能够使其中的蛋白质发生分解产生蛋白胨；产碱杆菌，自身无法使牛乳中的糖类发生分解而产酸，但能够生成棕黄色、灰黄色的色素，还能够导致牛乳中含有的有机盐发生分解而生成碳酸盐，从而导致牛乳呈碱性，能够造成乳制品发生黏性变质。
也就是说，嗜冷菌能够使牛乳中的成分被破坏，这主要是由于嗜冷菌能够分泌耐热蛋白酶、脂肪酶而导致蛋白质、脂肪发生分解。
另外，在有氧低温条件下，嗜冷菌能够引起生色反应，如黄色、奶油色、绿色、红色、金色、黑色或者棕褐色等。
牛乳微生物的污染来源
一、乳房中的微生物
在一般健康乳牛的乳房内，总有一些细菌存在。
由于这些细菌能适应乳房的环境而生存，因此，就把这些细菌统称为乳房细菌。
乳房内细菌主要存在于乳头管及其分枝处。
其中以小球菌属和链球菌属最为常见，其它棒状杆菌属和乳杆菌属等也可出现。
二、挤乳过程中的微生物
1．环境：牛舍空气、垫草、饲料、牛的粪便和土壤等，都含有大量的微生物。
2．不洁的牛体附着的尘埃和牛粪：含菌量可达几亿到几百亿，挤乳时它们极易散落到牛乳中。
多数属于带芽孢杆菌、大肠菌群等。
3．乳房、乳头的清洗程度：挤乳时都要用温水彻底清洗乳房。
未清洗7058个/ml、已清洗718个/ml。
4．挤乳用具和盛乳容器：附着的细菌多为耐热球菌，还有八叠链球菌和杆菌。
5．挤乳工人和其他管理人员也会把微生物带入乳液。
如：挤乳前，工人的手未严格清洗消毒，可能将微生物带入乳液；工作人员如是呼吸道或肠道传染病的带菌者，可能将病原菌传播到乳液中。
三、挤乳后微生物的污染和繁殖
1．乳液挤出后，应进行过滤、冷却，在此过程中所接触的空气、过滤器、容器等，都可能使其再污染微生物。
2．原料乳如果不及时加工或冷藏，乳液中的微生物就会增殖。
四、控制环境
1．挤乳前应将牛舍通风，并用清水喷洒地面，以减少舍中的尘埃。
挤乳后再进行喂饲。
2．清洗：在挤乳前，牛的乳房和乳头、挤乳工人的手应经严格的清洗消毒。
贮奶桶在使用后应及时进行清洗消毒。
3．挤乳：挤乳时要弃去最先挤出的少数乳液。
4．设备与运输：管道、设备、滤布等应定时清洗杀菌。
牛乳中细菌的生长变化作者：张佳柠来源：《科技与生活》2012年第05期摘要生牛乳的pH为中性，在牛奶放置过程中，温度，湿度，牛奶中的营养物质的多少等会导致其中细菌生长发生变化，因此牛乳中的pH也发生着变化。
本次实验研究在牛奶放置过程中的细菌生长变化以及酸奶的制作过程，故实验中将牛奶拆袋后室温下放置，并且设置时放置时间不同以作为对照。
实验中采用美蓝还原酶试验法测定细菌生长变化的生理值，并以此结果比较同一品牌不同包装的牛乳中细菌的生长变化情况。
关键词牛奶；细菌生长变化；利乐枕；塑料带包装中图分类号 TS252 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)031-0194-01牛乳是一种营养丰富的物质，当牛乳中存在微生物时，微生物的迅速繁殖引起牛乳的变质。
目前牛乳的消毒方法通常有两种：巴氏消毒法和超高温瞬时杀菌法（UHT）。
目前市场上的包装有袋和盒两种，称为利乐包装和塑料袋装。
贮藏条件涉及常温和低温；保存时间为3天-4天。
牛乳的细菌学检查方法有三种——显微镜直接计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板活菌计数法，本实验采用美蓝还原酶实验法来对牛乳中的细菌数做检验，现介绍这种方法：美蓝还原酶试验法：该法中用的美蓝是一种氧化还原作用指示剂，通过加入其中的美蓝颜色变化的速度，可以鉴定该牛乳的质量，其标准规定为：牛乳等级（腿色时间为指标）：一级：6 h-8 h，质量好；二级：2 h-6 h，中等；三级：30 min-2 h，质量差；四级：30 min，质量很差。
1 实验方法1.1 实验试剂伊利普通枕状利乐包装奶两袋、伊利普通塑料袋装奶两袋、三元特级鲜牛奶三袋、美蓝染液。
1.2 实验方法计划离实验分别还有96 h（四天），72 h（三天），48 h（两天）时，24 h（一天）打开牛乳包装，倒出40 mL牛奶于标记为1的纸杯中，封口。
1.3 实验流程制备培养基→生理盐水的分装→灭菌→美蓝还原酶试验法。
2 结果牛奶放置过程中伴随着pH的变化结果如表1所示。
牛乳中微生物的检测与分析张月月刘敏王荣峰王君孙鹏郭海萌张帅（山东农业大学生命科学学院，泰安271000）摘要：【目的】了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准。
学习牛乳的巴斯德消毒法和细菌学检查的方法。
【方法】采用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
【结果】微生物显微镜直接计数法随机性大，对茵体数量不能做出较为宏观，全面的反应．优点是计数快速；美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。
它不能做为定量检查；平板茵落计数法速度慢，需要平板上长出茵落一段时后才能计数。
【结论】由于平板茵落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大．由于是茵悬液涂布，所以比较均匀，能较好的反应茵落的疏密程度。
重复性，平行性很好。
是经典的计数方法。
关键词：牛乳;微生物;检测;分析Detection and analysis of microorganisms in milkYueyue Zhang，Min Liu，Rongfeng Wang，Jun Wang，Peng Sun，Haimeng Guo，Shuai Zhang (College of Life Sciences, Shandong Agricutual University, Tai’an, 271000, China)Abstract:【Purpose】to understand the milk sterilization and bacteriological examination of importance, and its hygienic quality judgment standard. Learning milk Pasteur disinfection method and bacteriological examination method. 【MEFHOD】Uses the microscope count the methylene blue reductase method，the standard plating count method to carry on the determination of the number of bacteria，determined different origin the fresh COWS milk rank，pasteurized milk hygienic standard．【RESULTS】Microorgaism microscope direct countmethod 。
It has big ran domness cannot make comparatively macroscopic ，overall comprehensive for milk quantity ．But the advantages are coninung and fast for counting of bacteria ；The methyrlene blue reductases method is used in determining the COW'S milk quality．It is simple．No special equipments needed．But it cannot use for the quantitative examination ；The plating colony count methods is relatively slow，needs the growth of bacteria on the plate and colonies can be counted．【CONCLUSION】Because the plating count method usually makes the gradient to dilution，therefore the counting linear scope is broad ．Because bacterium suspended solution is poured out on the culture of bacterium uniformly ．The bacterial colony density degree can obtain ．The retentiveness，parallelism is very good．It is the classical method of counting bacteria ．Key words: milk ；microbial ；detection；analysis；前言牛乳是一种营养全面的液态天然饮料,含有人体所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、各种矿物质和维生素[1] 。
其中的细菌会很快繁殖，因此，采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查，比较得出最佳检测方法，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
现今常用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，切入点不同的方法各有优缺。
随着人们生活水平的提高,对乳制品的需求亦不断上升。
目前国内对乳制品的研究主要集中在发酵酸奶上,但由于国人习惯消费短期内的乳制品,故巴氏杀菌乳在整个消费中仍占主导地位。
牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、检测大肠菌群、美蓝还原酶试验和标准平板计数法[2]，现通过试验来了解掌握牛乳的巴斯德消毒方法以及微生物细菌学检测方法,试验通过美蓝还原酶试验和标准平板计数法分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是否达标。
1材料与方法1.1实验器材1.1.1培养基和牛乳样品亚奥特巴氏消毒牛奶样品亚奥特巴氏消毒变质牛奶样品牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂15～20g 水1000ml PH 7.0～7.2 121℃灭菌20nin1.1.2溶液和试剂美兰溶液（1：250 000）无菌水1.1.3主要仪器和其他用品超净工作台，水浴锅，高压灭菌锅，酒精灯，恒温培养箱，9 cm无菌培养皿，无菌18×180mm试管，试管架。
无菌250ml三角瓶，无菌棉塞，移液枪与相应规格的无菌枪头1.2试验方法1.2.1材料预算，培养基配制，无菌水分装，高压灭菌。
1.2.2美兰还原酶试验法1)标记3个无菌试管1、2、32)分别向3个试管中加入10ml不同品牌的生鲜牛乳样品（1号变质亚奥特牛奶，2亚奥特纯牛奶，3号亚奥特纯牛奶）3)分别向试管中各加入1ml美兰，盖紧管塞4)轻轻倒转试管约4次，置于37℃水浴中，并记录培养时间5)测试管在水域中稳定5min中后，取出，轻轻倒转一次后再放回水浴中6)每隔30min观察记录试管中美兰颜色的变化，直至3～6h1.2.3巴斯德法消毒牛乳1)将水浴锅的温度调至80℃2)将牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布3)用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内，然后将试管放入调好温度的水浴锅中，水面要超过牛乳表面4)保持15min，并不时摇动5)一到15min立刻取出试管，用流水冲试管外壁，使其中的牛乳迅速冷却。
1.2.4标准平板计数法1)将巴氏消毒的牛乳样品充分摇匀，系列稀释至10-2、10-3和10 -4。
2)用1ml无菌吸管从三个梯度分别取1ml注入空白平板内3)各平板倾注约15ml已经融化并冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培4)凝固后，倒置于37 ℃培养箱内，培养24h。
5)选择长有30~300个菌落的平板计数，并计算出1ml牛乳中的细菌总数。
6)普通生牛乳样品中的检查同上法，但稀释度为10﹣3、10 -4和10-5。
2实验结果与分析2.1 实验结果2.1.1美蓝还原酶试验法结果见表1。
2.1.2 标准平板计数法结果见表2。
“﹨”表示无该梯度浓度，“——”表示没有菌落。
2.2结果分析2.2.1美蓝还原试验法1号试管为变质亚奥特牛奶还原时间为90min，所以牛乳质量为“四级奶”；2号试管为亚奥特纯牛奶还原时间为330min，故牛乳质量为“二级奶”。
3号试管为亚奥特纯牛奶未加美蓝溶液，作为观察颜色变化的对照实验组。
2.2.2标准平板计数法从实验结果来看，对于巴氏消毒后牛乳的标准平板计数，平行实验平板间菌落个数不相近，存在误差；梯度浓度间菌落个数差别较为明显。
未经巴氏消毒牛乳梯度浓度间菌落数目差别不明显。
3讨论3.1结果分析美蓝还原酶试验中三支试管中美蓝的还原时间与牛乳的质量较匹配，实验结果可度较高。
而标准平板计数法中由于各种原因导致实验数据较真实情况有较大差异，实验结果不准确，可信度不高。
3.2标准平板计数法试验失败原因分析1)未做空白平板的对照，导致培养皿菌落数无法对照2)无菌操作不到位，尤其是在接种和倒平板时，操作未在无菌圈内进行，导致培养皿污染，使实验结果不准确3)在培养时，未倒置培养4)由于没搞清楚牛乳中细菌的生长条件，在培养时用报纸包裹培养皿培养，导致实验结果与实际差异较大3.3 讨论美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。
它不能作为定量检查；平板菌落计数法速度慢,需要平板上长出菌落一段时后才能计数。
由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范围大。
由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度。
重复性,平行性很好,是经典的计数方法。
巴氏消毒后1ml牛奶中含菌数不超过30000符合我国消毒牛乳的卫生标准。
未经消毒的牛奶在培养基没长出菌落理论上是不应该的，首先因试验中每支试管中无菌水装了4.5ml，系列稀释时移液枪不够长很难吸取前一稀释度的溶液到后一试管，接下来也很难吸1ml稀释的溶液到培养皿进行培养，无法做3个平行，每个稀释度只做了一个平板，而且没做对照，无法确定培养基及操作方面的原因。
无菌水少也导致溶液混合不均匀，可能使加入培养皿的溶液含菌数少甚至不含菌。
其次，倒此组试验平板的培养基放置时间久，温度降低导致最后在三角瓶的培养基凝成块状，制出的培养基不均匀，不适宜细菌生长。
导致平板不长菌落还可能是系列稀释操作时枪头靠近酒精灯温度高把溶液中的细菌杀死了。
4. 结论牛乳的细菌学检查方法常用的有显微镜直接记数法、美蓝还原酶实验法、标准平板记数法。
显微镜记数法适用于含有大量细菌的牛乳, 生鲜牛乳可用此法检查。
如果显微镜检查,每个视野只有1～3 个细菌左右,此牛乳为一级牛乳; 如果牛乳中有很多长链球菌和白细胞,通常来自乳房炎的母牛;若一个视野中有很多不同的细菌,则往往是使用了脏器具保存的牛乳。
