叶绿素a提取方案

叶绿素-a的测定方法原理（荧光分光光度法）用丙酮溶液提取浮游植物色素进行荧光测定，根据提取液酸化前后的荧光值，可分别计算叶绿素-a及脱镁色素的含量。

试剂及其配置1、丙酮溶液（9+1）：量取900ml丙酮与100ml水混合，保存在棕色试剂瓶中。

2、碳酸镁悬浮液（10g/L）:称取1g碳酸镁，加水至100ml，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需要再摇匀。

3、盐酸：=1.18g/ml4、盐酸溶液（5+95）：在搅拌下，将5ml盐酸缓慢的加到95ml水中，混匀，保存于滴定瓶中。

5、硅胶仪器及设备1、荧光计2、冰箱3、离心机4、电动吸引器5、过滤装置6、玻璃纤维滤膜：直径为25mm的WhatmanGF/C或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜7、具塞离心管：容量10ml8、干燥器9、棕色试剂瓶：容量100ml，1000ml10、量筒：容量100ml、200ml、1000ml11、定量加液器：容量10ml12、镊子一般实验室常用设备分析步骤1、样品制备量取一定体积海水（通常大洋水250ml-500ml，近岸或港湾水50-100ml），加2ml 碳酸镁悬浮液，混匀，用玻璃纤维滤膜或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜过滤，过滤负压不得2超过50KPa.2、样品提取将过滤了的样品的滤膜放入具塞离心管，加入10ml丙酮溶液，摇荡，放置冰箱冷藏室14-24h，提取叶绿素-a。

若虑得的样品不能及时提取，应该将滤膜抽干、对折，再套上一张滤纸置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1摄氏度的冰箱中。

3、样品离心离心速度：（3000-4000）r/min离心时间:10min4、样品测定荧光计激发波长为436nm,发射波长670nm零点调节：用丙酮溶液调节，使荧光计指针指零。

将提取的上层提取液注入测定池。

选择相应量程，测定样品的荧光值R b。

加2滴盐酸溶液至测定池，摇匀，经30s后再测其荧光值Ra。

5、仪器校正用标准叶绿素-a校正。

用分光光度计校正：取一定体积正处于指数增长期的单细胞藻类培养液，依上述方法提取其叶绿素-a，用分光光度法测定，计算该提取液的叶绿素-a浓度。

叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。

（二）水样的采集与保存1.确定具体采样点的位置2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL5.将采样瓶拧上并编号6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器：1.分光光度计2.比色池：10mm3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm）4.研钵5.常用实验设备试剂：1.碳酸镁悬浮液：1%。

称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。

每次使用时要充分摇匀2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。

将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。

（五）实验步骤1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。

2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。

3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。

将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。

此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。

4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。

实验四、叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定刘家富（40508014）05生科（一）一、实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。

由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。

（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数)因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。

测定663nm和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。

其校正过的公式为：C a＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LC b＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L二、仪器药品剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液、天平、研钵、滤纸三、操作步骤1. 叶绿体色素的提取取去中脉叶片（2g左右），剪碎后加入少量石英砂、碳酸钙、纯丙酮5ml后放入研钵研磨成匀浆成深绿色提取液，之后用漏斗过滤。

实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定一、实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素中测定叶绿素a、叶绿素b的方法。

二、实验原理；根据叶绿体色素提取液对可见光的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测其吸光度，即可利用公式计算出提取液中各种色素的含量：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649-7.32 A665C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665三、仪器、试剂与材料：仪器：分光光度计、离心机、研钵；试剂：96%乙醇溶液、石英砂、CaCO3粉末；材料：菠菜叶片；四、实验步骤：1.取干净的菠菜叶片剪碎，分别混匀。

2.称取剪碎的样品0.2g，各2份，分别放入研钵中，加少量石英砂和CaCO3粉末、及2-3ml 96%乙醇溶液，研成匀浆，倒入离心管，再用96%乙醇溶液多次洗涤研钵，洗涤液也倒入离心管中。

3．将离心管放入离心机后取上述提取液放入比色皿中，以96%乙醇为对照，分别测定665nm、649nm处的吸光度值。

4.按公式计算提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。

五、实验结果及分析：1.研磨提取叶绿素是加入石英砂和CaCO3粉末各有什么作用？加入石英砂有助于研磨得更充分；加入CaCO3粉末可以保护叶绿素在研磨时不被破坏。

2.计算: A665(1)=0.399A A665(2)=1.237A 故A665=0.818AA649(1)=0.208A A649(2)=0.626A 故A649=0.417A 所以: Ca=13.95A665-6.88A649=8.542Cb=24.96A649-7.32 A665=4.421C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665=12.963。

叶绿素a的测定原理叶绿素a是一种存在于植物和藻类细胞叶绿体中的绿色色素，它起到了光合作用中接受和传递光能的关键作用。

测定叶绿素a的浓度对于研究光合作用的机制以及评估植物和藻类的生长状态具有重要意义。

在实验室中，存在多种方法来测定叶绿素a的浓度，其中包括光度法、荧光法和高效液相色谱法。

下面将重点介绍常用的光度法测定叶绿素a的原理和步骤。

光度法是一种通过测量溶液对特定波长的光的吸收来确定溶液中某种组分浓度的方法。

对于叶绿素a的测定，通常使用的波长为650nm或663nm。

叶绿素a在这两个波长的光下有很强的吸收能力，而溶液中的其他组分对该波长的光吸收较小。

因此，测定叶绿素a的浓度可以通过测量溶液对650nm或663nm光的吸光度来间接确定。

下面是光度法测定叶绿素a浓度的一般步骤：1. 样品制备：将待测样品中的叶绿素a提取到有机溶剂中，一般使用甲醇、乙醇或二氯甲烷等极性较强的有机溶剂作为提取剂。

提取的方法可以根据需求选择，包括搅拌法、超声波法或研磨法等。

提取过程需要避光，以防叶绿素a被光降解。

2. 溶液制备：将提取出的叶绿素a溶解在适当的溶剂中，一般使用甲醇或乙醇等有机溶剂。

溶液中的叶绿素a浓度可以通过分光光度计测定吸光度来确定。

3. 吸光度测定：使用分光光度计，在650nm或663nm的波长下测量样品吸光度。

为了获得准确的测量结果，一般需要对比测量待测样品和纯溶剂的吸光度，以消除对溶剂的吸光干扰。

4. 计算叶绿素a浓度：根据比色法或校正曲线法，将测得的吸光度转换为叶绿素a的浓度。

比色法是通过比较待测样品吸光度与已知浓度叶绿素a标准溶液吸光度的关系，进行定量测定。

校正曲线法是首先制备不同浓度的叶绿素a标准溶液，然后测定它们的吸光度并绘制出吸光度与浓度的标准曲线，通过待测样品的吸光度在标准曲线上插值得到其浓度。

需要强调的是，在测定叶绿素a浓度时，有几个实验注意事项需要注意。

首先，提取过程需要避光，以免叶绿素a被光降解，影响测量结果。

叶绿素的提取与分析测定叶绿素的提取与分析测定是一项重要的生物技术实验，主要用于研究植物光合作用中的重要色素——叶绿素。

下面将详细介绍实验的步骤、方法和数据分析。

一、实验目的本实验旨在提取和分析测定叶绿素，了解其在植物光合作用中的重要作用，并为进一步研究植物生长和发育提供基础数据。

二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，它能够吸收太阳光能，并将其转化为化学能，为植物的生长和发育提供能量。

叶绿素广泛存在于植物的绿色组织中，尤其在叶片中含量最为丰富。

本实验将采用有机溶剂（如乙醇、丙酮等）从植物组织中提取叶绿素。

提取后的叶绿素可通过分光光度法进行定量分析。

三、实验步骤1.样品准备：选取新鲜植物组织（如叶片），用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，称取一定质量（m）的样品备用。

2.叶绿素提取：将样品放入研钵中，加入适量有机溶剂（如乙醇-丙酮混合液），研磨成匀浆。

将匀浆转入离心管中，于低温下离心（如4℃、10000 r/min），收集上清液备用。

3.叶绿素定量分析：取一定体积（V）的上清液，加入适量蒸馏水稀释，用分光光度计在663nm和646nm波长下测定吸光度（A）。

根据朗伯-比尔定律，叶绿素的浓度（C）可由吸光度计算得出。

公式如下：C = (11.77A663 -2.59A646) / m / V4.数据记录：记录每个样品在各波长下的吸光度，并计算出叶绿素浓度。

5.数据分析：对所得数据进行统计分析，比较不同样品间的叶绿素含量差异，并绘制柱状图或饼图等图形表示结果。

四、实验结果与数据分析假设我们选取了三种不同植物的叶片进行实验，以下是实验所得的数据：1.三种植物叶片中叶绿素的含量存在差异，其中样品1的叶绿素含量最高，样品3的含量最低。

这可能与不同植物的生物学特性有关。

2.根据所得数据绘制柱状图或饼图等图形，可以直观地展示不同样品间的叶绿素含量差异。

这有助于我们进一步了解植物间的差异以及叶绿素在植物生长和发育中的作用。

叶绿素a 、b 含量测定含量测定【实验目的】熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。

的方法及其计算。

【实验原理】 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

到两种组分的含量。

如图3-3叶绿素a 和b 的吸收光谱曲线，叶绿素a 的最大吸收峰在663nm ，叶绿素b 在645nm ，吸收曲线彼此又有重叠。

，吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert-Beer 定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与光密度OD 之间有如下的关系：之间有如下的关系：OD 1=C a ·k a1+C b ·k b1 （1）OD 2=C a ·k a2+C b ·k b2 （2）式中：C a 为组分a 的浓度，g/L ；C b 为组分b 的浓度，g/L ；OD 1为在波长λ1（即组分a 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；OD 2为在波长λ2（即组分b 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；k a1为组分a 的比吸收系数，即组分a 当浓度为1g/L 时，于波长λ1时的光密度OD 值；值；k b2为组分b 的比吸收系数，即组分b 当浓度为1g/L 时，于波长λ2时的光密度OD 值；值；k a2为组分a （浓度为1g/L ），于波长λ2时的光密度OD 值；值；k b1为组分b （浓度为1g/L ），于波长λ1时的光密度OD 值；值；从文献中可以查到叶绿素a 和b 的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下：值如下：波 长（nm ）叶绿素a 叶绿素b 66382.04 9.27 645 16.75 45.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：），则得：OD 663=82.04×=82.04×C C a +9.27×+9.27×C C bOD 645=16.75×=16.75×C C a +45.60×+45.60×C C b经过整理之后，即得到下式：经过整理之后，即得到下式：C a =0.0127 OD 663-0.00269 OD 645C b =0.0229 OD 645-0.00468 OD 663如果把C a ，C b 的浓度单位从原来的g/L 改为mg/L ，则上式可改写为下列形式：，则上式可改写为下列形式： C a =12.7 OD 663-2.69 OD 645 （3）C b =22.9 OD 645-4.68 OD 663 （4）C T = C a + C b =8.02 OD 663+20.21 OD 645 （5）（5）式中C T 为总叶绿素浓度，单位为mg/L 。

叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定目录一、内容概括 (2)1. 叶绿素简介 (2)2. 叶绿素a与叶绿素b的重要性 (3)二、实验原理 (4)1. 叶绿素a与叶绿素b的光谱特性 (5)2. 鉴定原理 (5)三、材料与方法 (6)1. 实验材料 (7)样品来源 (8)样品处理 (8)2. 实验仪器与试剂 (9)萃光仪 (10)分光光度计 (10)缓冲液 (11)3. 实验步骤 (12)样品提取 (12)测定波长 (13)重复测定 (14)四、结果分析 (15)1. 叶绿素a与叶绿素b的吸收光谱图 (16)2. 数据处理与结果解读 (17)3. 结果讨论 (18)五、结论 (20)1. 快速鉴定叶绿素a与叶绿素b的效果 (21)2. 实验的局限性及改进方向 (21)一、内容概括本文档旨在介绍叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定方法。

内容将涵盖叶绿素a和叶绿素b的基本性质、特点及其在生物体系中的重要性。

本文还将详细阐述快速鉴定叶绿素a和叶绿素b的流程和步骤，包括实验前的准备、实验操作的具体步骤以及结果的解析。

还将提及一些可能出现的问题以及解决策略，以确保实验的准确性和可靠性。

本文档旨在为研究人员、学生及叶绿素相关领域的从业者提供一种便捷、高效的鉴定方法，以推动相关领域的研究进展。

1. 叶绿素简介又称植物色素，是植物中一类重要的绿色色素，广泛存在于高等植物、藻类和某些微生物中。

它们是植物进行光合作用的关键色素，通过吸收和转化光能，将二氧化碳和水转化为有机物质，并释放氧气。

叶绿素的结构中包含一个镁原子，其骨架由两个吡咯环和一个碳链组成，这使得叶绿素具有特定的光谱特性，能够在特定波长下吸收光。

叶绿素a和叶绿素b是叶绿素中最主要的两种类型，它们在结构上有所不同。

叶绿素a的分子结构中除了镁原子外，还包含一个长链的碳链和一个醛基，这使得它呈现出蓝绿色的特征。

而叶绿素b的分子结构中则不含醛基，因此它呈现出黄绿色。

尽管这两种叶绿素在颜色上有所差异，但它们在光合作用中的作用却是相同的。