水蛭粉中天然水蛭素的测定方法

水蛭及其炮制品中水蛭素的测定
戴作波
【期刊名称】《求医问药（学术版）》
【年(卷),期】2012(010)012
【摘要】目的:研究水蛭及其炮制品中水蛭素的测定方法.方法:通过水蛭的炮制、制备提取液、配制缓冲液、配制凝血酶滴定液及水蛭素含量的测定,对水蛭及其炮制品中水蛭素进行测定.结果:生水蛭中水蛭素含量最高,其次为滑石粉烫水蛭,含量最低的为砂烫水蛭.结论:生水蛭中有效成分水蛭素的含量最高,可能原因是砂烫和滑石粉烫后高温导致水蛭素这种蛋白质变性.
【总页数】2页(P343-344)
【作者】戴作波
【作者单位】江苏省宝应县中医医院江苏宝应225800
【正文语种】中文
【中图分类】R283
【相关文献】
1.凝血酶时间法测定家兔尿液及胆汁中r-水蛭素 [J], 阎宇辉;王一楠;韩国柱;任洪灿;周峰;罗轶;陈晓芳;姜伟
2.凝血酶时间法测定家兔血浆中重组水蛭素 [J], 任洪灿;芮明;韩国柱;吕勇;李颖;肖述;叶红伟
3.凝血酶滴定法测定云南菲牛蛭中水蛭素含量的改进研究 [J], 张利;李志远;风云昉
4.斑点免疫印迹法快速测定水蛭炮制品中水蛭素水解产物含量 [J], 王厚伟;田景振
5.水蛭中水蛭素含量测定的改进 [J], 范尚坦;李金兰;张勇;赖丽萍
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染色
考马斯亮蓝G250：20mg溶于10ml 95％ 乙醇，加入20ml磷酸，用双蒸水定容至 200ml，定容前用玻璃棒搅溶。（在恒温箱 中染色20分钟）
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脱色
25％甲醇，7.5％乙酸，室温振摇下脱色， 总共配置200ml。
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总结
1.在进行水蛭粉末获取时，是否直接将整个水蛭搅碎就能 使用了。 2.当抽干仪温度为52度会不会改变水蛭素的性质 3.在水液减压浓缩蒸压干燥得纯化样品A和B时，应用小离 心管或称量纸收集精品A和B 4.点样时加可溶性淀粉对水蛭素的水性溶是否有影响
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精制
将粗品A和B分别溶于250和200ml蒸馏水中，各装入已捡漏的透析 袋(析袋MW值为6000)，扎紧上口，放置有蒸馏水的烧杯中，4度冰箱
放置，每隔8小时换水，连续透析48h，取出透析袋，水液减压浓缩蒸
压干燥得纯化样品A和B,A得量1.19克，收率7.9％，B得量0.21克，收 率1.4％。（按书上介绍;A的收率应为0.104％，B收率为0.0825％)
水蛭素
水蛭素抗凝血物质的提取
粗品提取： 粉碎水蛭样品15g，生理盐水225ml，4度冰箱放置24h，倾出上清 （上清液的PH为7.4)，同法提取3次，合并提取液，磷酸调PH至4.4， 冷贮12h，取上清（上清液的PH为4.6) ，加入无水乙醇使其含量为61 ％，（加入乙醇后溶液的PH为6.6）（无水乙醇本身的PH为8.4）用稀 盐酸调PH至6，放置过夜，倾出上清（该上清的PH为6.1），沉淀用61 ％的乙醇洗涤3次，抽干得粗品A，滤液合并于上清液，再加入乙醇使 其含量为85％，静置24h后同同前处理取沉淀物洗涤抽干（抽干时仪 器调的温度为52度）得到粗品B。 加入无水乙醇使其含量为61％,用稀盐酸调PH至6

水蛭素的提取及含量测定HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,V o1.33No.4?87?水蛭素的提取及含量测定田丽华,刘娟,刘利成(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C 端含有较多的酸性氨基酸,可以结成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能提取批量水蛭素的方法.水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和一个NIH凝血酶的水蛭索量.1实验仪器,材料及试剂本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学院生药学教研室主任刘娟教授鉴定.BSZ一2型自动双重纯水蒸馏仪(上海之信仪器有限公司),5L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),10/~L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),酶示板.凝血酶(北京生物制品研究所);纤维蛋白原(上海市生物制品研究所);双重蒸馏水(自制);L一精氨酸(北京生物制品研究所);牛肠系膜(佳木斯肉联厂);氯化钠(分析纯);生理盐水(黑龙江省肇东市华富药业有限责任公司).2实验方法2.1诱导法本实验对活体的诱导有两种方法,一种用不同浓度的氯化钠溶液组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,收集水蛭唾液腺分泌物,测定水蛭素含量,比较结果.另一种是用氯化钠和L一精氨酸组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,测定水蛭素含量,比较结果.2.1.1不同浓度的氯化钠溶液诱导配制浓度为0.9%的氯化钠溶液(即生理盐水),分别稀释至浓度为0.45和0.225的氯化钠溶液(即1/2生理盐水和1/4生理盐水),装入3个小试剂瓶里,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.1.2氯化钠加L一精氨酸诱导配制150mm的氯化钠溶液,分别装于5个小试剂瓶中,分别加人lmmol,2mmol,4mmol,6mmol的L一精氨酸,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.2凝血酶滴定法2.2.1凝血酶滴定法原理本实验对水蛭索的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血时起中心作用,在凝血具体方法如下:配制不同梯度(2ONIH/mL,4ONIH/mL,8ONIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭索含量进行测定, 在酶示板小孔中加200p.L0.5的纤维蛋白原(0.05mol/L) Tris—HCL缓冲液(pH7.4)再加入10—1OOL水蛭素溶液,充分混均.用微量注射器吸取标准的凝血酶溶液(2ONIH单位)5L(即0.1NIH单位),若在lmin内纤维蛋白原发生凝固,即说明已经达到滴定终点.若没有发生凝固,则换取4ONIH/mL单位的凝血酶溶液进行滴定,若仍没有凝固,则逐步扩大范围直至确定活性范围.3结果表1氯化钠溶液诱导结果表2氯化钠+L一精氨酸诱导结果(U一4O)4结论通过应用仿生诱导的方法对活体水蛭进行诱导后比较发现,当诱导溶媒为不同浓度氯化钠溶液时,其最佳的提取浓度为0.9,也就是生理盐水组的提取效果较好.当诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸时.发现150mLNaC1加4mL一精氨酸组的效果最好,能够得到最大剂量的水蛭素.综合两种诱导溶媒发现,诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸的效果较好.本实验对水蛭素含量测定采用改进后的凝血酶滴定法,即逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭分泌的唾液进行含量测定时,具有节省时间,重复性和准确度都较好的优点.(收稿日期:201O—O4—07)黑龙江省研究生创新基金科研项目,项目编号:YJSCX2OO8—063HLJ 作者简介:田丽华(196O～)女,黑龙江佳木斯人,高级实验师.。

水蛭粉标准
性状：本品体长稍扁，乍视之似圆柱形，体长约2～2.5厘米，宽约2～3毫米。

背面绿中带黑，有5条黄色纵线，腹面平坦，灰绿色，无杂色斑，整体环纹显著，体节由5环组成，每环宽度相似。

鉴别：本品粉末棕黄色。

体壁细胞纵断面观呈长条形，壁薄，近角质层处一边微向内卷曲，并附有细长的透明颗粒；另一边与角质层相连处平坦。

横断面观呈长梭形，表面有极细的凹凸纹。

检查：水分不得过百分之十八。

浸出物：照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法（通则2201）测定，用乙醇作溶剂，不得少于百分之二。

炮制：水蛭粉需要除去杂质，洗净、干燥后打粉。

水蛭粉的注意事项：
孕妇禁用。

切忌与寒凉食物同食。

忌烟酒、茶、辛辣等刺激性食物。

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂：电子天平 酸度计 离心机 移液器 45度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl ） 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：1、称取1.21g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.2mol/L 。

2、用移液器取429ul 盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.1ml/L 。

3、从1去25ml ，从2取40ml 混合调PH 到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ml 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。

6、取3（Tris 缓冲液）1.6ml ，稀释纤维蛋白原0.008g ，浓度0.5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

8、从5取上清液100ul 。

9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。

11、计算公式为：2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度C2=样品的浓度V1=滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样100ul检测，检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul检测，检测步骤和计算方法不变。

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂:电子天平 酸度计 离心机 移液器 ４5度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl) 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：１、称取1.2１g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解,定溶到50ml,浓度为０.２mol/L 。

2、用移液器取４29ul 盐酸加蒸馏水充分溶解,定溶到５０ml ，浓度为0.1ml/Ｌ。

３、从1去25ｍl,从2取４0ｍl 混合调ＰＨ到７.4（用1或2调)，加蒸馏水定溶到10０ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ｍl 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟,4000转/分。

6、取3(Ｔri ｓ缓冲液)１.6ｍl,稀释纤维蛋白原0.00８g,浓度0．5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

８、从5取上清液10０ul 。

９、从6取200ｕl 加入８充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从７每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管,观察反应,溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数)。

11、计算公式为:2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度Ｃ２=样品的浓度V１＝滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过５次还不凝固的,应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5ｕ/次，改为４ｕ/次,3ｕ/次，2ｕ/次，１u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样10０uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后,取溶液1０0uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。

仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。

试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。

溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。

2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。

3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。

分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。

３ 结 果
表 １ 氯 化钠 溶 液诱 导 结 果
１
实验 仪 器 、 料 及 试 剂 材
本 实 验 所 用 水 蛭 购 于 山东 省 济 宁 市 ， 佳 木 斯 大 学 药 学 经 院生药学教研室主任刘娟教授鉴定 。 Ｂ Ｚ ２ 自动 双 重 纯 水 蒸 馏 仪 （ 海 之 信 仪 器 有 限 公 Ｓ一 型 上 司 ） ５ Ｌ微 量 进 样 器 （ 海 安 亭 微 量 进 样 器 厂 ） １／ 微 量 ， 上 ，０ Ｌ ￣ 进样 器 （ 海 安 亭 微 量进 样 器 厂 ） 酶示 板 。 上 ， 凝 血 酶 （ 京 生 物 制 品 研 究 所 ） 纤 维 蛋 白 原 （ 海 市 生 北 ； 上 物 制 品 研 究所 ） 双 重 蒸 馏 水 （ ； 自制 ）Ｌ一精 氨 酸 （ 京 生 物 制 ； 北 品研 究 所 ） 牛 肠 系 膜 （ 木 斯 肉 联 厂 ） 氯 化 钠 （ 析 纯 ） 生 ； 佳 ； 分 ； 理 盐 水 （ 龙 江 省 肇 东 市 华 富 药业 有 限 责 任 公 司 ） 黑 。
２ 实 验 方 法
２ １ ． 诱 导 法
表２ 氯化钠＋Ｌ 精氨酸诱导结果 （ 一 Ｕ一４ ） Ｏ
本 实 验对 活 体 的诱 导 有 两 种 方 法 ， 种 用 不 同 浓 度 的氯 一
关 键 词 ： 蛭 素 ； 生诱 导 ； 血 酶 滴 定 水 仿 凝 中 图分 类 号 ； ８ 文 献 标 识 码 ： Ｒ２ ４ Ａ 文章 编 号 ： ０ ８ １ ４ ２ １ ） ４ ０ ８ —０ １ ０ —０ ０ （ ０ Ｏ ０ — ０ ７ １
水 蛭 素 是 从 水 蛭 中 提 取 的 一 种 酸 性 多 肽 ， 临 床 上 多 用 在 于 治 疗 不 稳 定 性 心 绞 痛 （ Ａ） 急 性 心 肌 梗 死 （ ） 血 管 形 ＵＳ ， ＡＭ ， 成术 ， 血液 透 析 ， 外 循 环 ， 移 植 （ Ｒ Ｔ）弥 漫性 血 管 内 凝 体 肾 Ｃ Ｒ ， 血 （Ｉ 等病症 。 Ｄ Ｃ） 天 然 水 蛭 索 的 分 离 与 纯 化 主 要 包 括 从 活 体 水 蛭 素 和 干 水 蛭 中分 离 提 取 水 蛭 素 。 统 的 水 蛭 素 的 获 得 是 对 水 蛭 的 一 传 次性 掠夺， 本 实验 采用诱 导方 法对活 体水蛭 素 的提取 ， 而 避 免 了 传 统 方 法 对 水 蛭 的 一 次 性 掠 夺 ， 护 了 水 蛭 的 野 生 资 保 源 ， 带 动 了水 蛭 养 殖 业 的 发 展 。 内 曾 报 道 了 一 种 能 利用 又 国 水 蛭 反 复 吸 血 并 用 其 嗉 囊 消 化 液 为 原 料 ， 不 杀 死 水 蛭 又 能 既 提取批量水蛭素的方法 。 水 蛭 素 的 含 量 测 定 方 法 有 多 种 ， 生 物 底 色 法 、 血 酶 如 凝 滴 定 法 、 散 射 法 、 联 免 疫 法 吸 附测 定 法 、 位 素 标 记 示踪 光 酶 同 法 等 。 实 验 采 用 凝 血 酶 滴 定 法 ，９０ Ｍａｋ ｒｔ 道 了 本 １７ 年 ｒｗａｄ 报 凝 血 酶 滴 定 法 ， 原 理 是 根据 水 蛭 素 与 凝 血 酶 结 合 比例 为 １ 其 ： １ｍｏ／ １和 １ ５ ｇ ｇ 。 血 酶 的 国 际 单 位 ＮＩ 水 蛭 素 的 （ ｌｍｏ） ： （／ ） 凝 Ｈ， 活 性 以 抗 凝 血 酶 活 力 单 位 ＡＴＵ 表 示 ， 个 ＡＵＴ 等 于 中 和 一 个 ＮＩ 凝 血 酶 的水 蛭 索 量 。 Ｈ

《中国药典》：水蛭《中国药典》:水蛭【拼音名】Shuǐ Zhì【英文名】 HIRUDO【别名】蚂蝗、马鳖、肉钻子【来源】本品为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whit-mania acranulata Whitman 的干燥体。

夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥。

【性状】蚂蟥：呈扁平纺锤形，有多数环节，长4～10cm,宽0.5～2cm。

背部黑褐色或黑棕色，稍隆起，用水浸后，可见黑色斑点排成5条纵纹；腹面平坦，棕黄色。

两侧棕黄色，前端略尖，后端钝圆，两端各具1吸盘，前吸盘不显着，后吸盘较大。

质脆，易折断，断面胶质状。

气微腥。

水蛭：扁长圆柱形，体多弯曲扭转，长2～5cm，宽0.2～0.3cm。

柳叶蚂蟥：狭长而扁，长5～12cm,宽0.1～0.5cm。

【炮制】水蛭：洗净，切段，干燥。

烫水蛭：取净水蛭段，照烫法（附录ⅡD）用滑石粉烫至微鼓起。

【性味】咸、苦，平；有小毒。

【归经】归肝经。

【功能主治】破血，逐瘀，通经。

用于症瘕痞块，血瘀经闭，跌扑损伤。

【用法用量】 1.5～3g。

【注意】孕妇及无瘀血者禁用。

【贮藏】置干燥处，防蛀。

【摘录】《中国药典》页首《*辞典》:水蛭【出处】《本经》【拼音名】Shuǐ Zhì【别名】蛭蝚、至掌、虮（《尔雅，），马蜞（陶弘景），马蛭（《唐本草》），蜞、马蟥（《本草图经》），马鳖（《本草衍义》），红蛭（《济生方》），蚂蝗蜞（《医林纂要》），黄蜞（《本草求原》），水麻贴（《河北药材》），沙塔干、肉钻子（《中药材手册》），门尔哥蚂里（朝名）。

【来源】为水蛭科动物日本医蛭、宽体金线蛭、茶色蛭等的全体。

【原形态】①日本医蛭，又名：医用蛭。

体狭长稍扁，略呈圆柱形，体长3～5厘米，宽4～5毫米（固定）。

背面绿中带黑，有黄色纵线5条。

腹面子坦，灰绿色，无杂色斑纹。

体环数103；环带不显着，占15环。

一种水蛭素的提取方法水蛭素是一种具有多种药理活性的天然化合物，具有抗炎、镇痛、抗凝血等作用，被广泛应用于医药和美容领域。

本文将介绍一种简单高效的水蛭素提取方法，以供科研和产业生产的参考。

材料与仪器* 新鲜水蛭：选取健康、体型完整的水蛭。

* 太谷螺旋藻培养基：提供养分供给水蛭生长。

* 纯化水：用于制备培养基和药物溶液。

* 离心机：用于离心沉淀物。

* 氮气进样仪：用于干燥药物溶液。

* 恒温振荡器：用于混合反应液。

* 深冷冰箱：用于保存样品。

提取步骤第一步：养殖水蛭1. 选择健康的水蛭，放入适量的太谷螺旋藻培养基中。

2. 在25恒温振荡器中进行培养，光照条件为12小时光照和12小时黑暗。

第二步：药物制备1. 取适量新鲜的水蛭，洗净表面的杂质和细菌，切碎成细小的颗粒。

2. 将切碎的水蛭放入50mL的纯化水中，放入恒温振荡器中搅拌1小时。

3. 将搅拌后的液体进行离心，沉淀物收集。

4. 用纯化水洗涤沉淀物，重复此步骤3次，直至收集到纯净的水蛭提取物。

5. 将水蛭提取物通过氮气进样仪进行干燥，获得干燥的水蛭提取物。

第三步：提取与纯化1. 将干燥的水蛭提取物溶解于适量的纯化水中，形成水蛭提取液。

2. 将水蛭提取液通过滤纸进行过滤，去除大颗粒杂质。

3. 用离心机将液体进行离心，沉淀物收集。

4. 用纯化水洗涤沉淀物，重复此步骤3次，直至得到纯净的水蛭素。

5. 将水蛭素溶解于纯化水中，进行浓缩。

第四步：质量检测1. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测水蛭素的含量和纯度。

2. 通过比对标准品，确定水蛭素的相对含量。

结论本文介绍了一种简单高效的水蛭素提取方法，通过养殖水蛭、药物制备、提取与纯化、质量检测等步骤，可以获得纯净的水蛭素。

这种方法操作简便，提取效果良好，为水蛭素的研究和生产提供了可靠的技术支持。

但需要注意的是，提取过程中应采取严格的无菌操作，以确保提取物的纯度和质量。

希望本文能为水蛭素的提取方法研究提供参考，为医药和美容领域的发展贡献力量。

Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪 （ 包 括 四 元 泵、 DAD 检 测 器、自 动 进 样 器、ChemStation 工 作 站 ） ； Mettler Toledo AG285 电子天平（ 瑞士 Mettler Toledo 公司） ； DFT － 100 中药粉碎机（ 温岭市大德中药机 械有限公司） ； H1650 － W 台式微量高速离心机（ 长 沙湘仪离心机仪器有限公司） 。
LIU Wu － zhan，FAN Jian － wei* ，LI Yan － fang，QIU Xin － jian， LIU Xiang － dong，SU Ｒui － qiang* ，ZHAO Zhi － quan
（ State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine，Shandong Provincial Key Laboratory of New Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine，Lunan Pharmaceutical Group Co． Ltd，Linyi 276006，China）
DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.08.004
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34（ 8）
— 1417 —
HPLC 法同时测定水蛭（ 蚂蟥） 中 7 个成分的含量
刘武占，范建伟* ，李艳芳，邱新建，刘向东，苏瑞强* ，赵志全
（ 鲁南制药集团股份有限公司，中药制药共性技术国家重点实验室，山东省中药制药新技术重点实验室，临沂 276006）

水蛭素的分离纯化与检测方法研究进展
杨立新;秦海娜;李晓晖;修志龙
【期刊名称】《水产科学》
【年(卷),期】2005(024)002
【摘要】天然水蛭素是从水蛭的唾液腺中分离出来的一种多肽，分子量7000道尔顿，由64-66个氨基酸组成。

水蛭素N端由二硫键形成的紧密结构能与凝血酶活性位点结合，其C端富含酸性氨基酸残基，则与凝血酶的纤维蛋白原结合位点结合，从而对凝血酶有高度特异的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。

在临床上多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)，
【总页数】3页(P37-39)
【作者】杨立新;秦海娜;李晓晖;修志龙
【作者单位】鞍山科技大学,生物工程系,辽宁,鞍山,114044;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024
【正文语种】中文
【中图分类】S968
【相关文献】
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第1篇一、实验背景水蛭，又称蚂蟥，是一种传统的中药材，历史悠久，在《神农本草经》中已有记载。

现代研究表明，水蛭含有多种生物活性物质，如水蛭素、抗凝血酶、纤溶酶等，具有显著的抗凝血、改善心脑血管疾病、缓解风湿病、治疗皮肤病等功效。

本实验旨在通过一系列实验，验证水蛭的这些功能。

二、实验材料与方法1. 实验材料：- 水蛭：购自当地中药材市场，新鲜水蛭，经过筛选和清洗。

- 实验动物：大鼠、小鼠，购自实验动物中心，健康成年动物。

- 试剂与仪器：凝血酶、纤维蛋白原、ADP、垂体后叶素、胆固醇结晶、毛细血管等。

2. 实验方法：（1）抗凝血功能实验：- 将大鼠分为实验组和对照组，实验组给予水蛭提取物，对照组给予等量生理盐水。

- 观察两组动物的凝血时间、出血时间和血块溶解时间等指标。

（2）改善心脑血管疾病实验：- 将小鼠分为实验组和对照组，实验组给予水蛭提取物，对照组给予等量生理盐水。

- 通过观察实验组小鼠的心率、血压、血脂等指标，评估水蛭对心脑血管疾病的影响。

（3）缓解风湿病实验：- 将大鼠分为实验组和对照组，实验组给予水蛭提取物，对照组给予等量生理盐水。

- 通过观察实验组大鼠的关节疼痛、肿胀等指标，评估水蛭对风湿病的影响。

（4）治疗皮肤病实验：- 将小鼠分为实验组和对照组，实验组给予水蛭提取物，对照组给予等量生理盐水。

- 通过观察实验组小鼠的皮肤炎症、瘙痒等指标，评估水蛭对皮肤病的影响。

三、实验结果1. 抗凝血功能实验：- 实验组大鼠的凝血时间、出血时间和血块溶解时间均显著短于对照组，表明水蛭提取物具有显著的抗凝血作用。

2. 改善心脑血管疾病实验：- 实验组小鼠的心率、血压、血脂等指标均显著优于对照组，表明水蛭提取物对心脑血管疾病具有改善作用。

3. 缓解风湿病实验：- 实验组大鼠的关节疼痛、肿胀等指标均显著低于对照组，表明水蛭提取物对风湿病具有缓解作用。

4. 治疗皮肤病实验：- 实验组小鼠的皮肤炎症、瘙痒等指标均显著低于对照组，表明水蛭提取物对皮肤病具有治疗作用。

水蛭素的提取方法有哪些？
1、传统方法：由于天然水蛭素存在于吸血水蛭唾液腺及其所分泌的唾液中，传统提取天然水蛭素的方法通常是采用日本医蛭头部或整体进行提取天然水蛭素。

其常规提取方法是：以吸血水蛭的头部为原料，因为水蛭躯体中有较大量的结构与水蛭素相似，但无生物活性的“伪水蛭素”组分存在，它的存在将增加水蛭素分离的难度。

利用水-丙酮混合剂萃取或经过乙醇分级沉淀、即得水蛭素粗制品溶液，然后采用层析法（如凝胶层析法、亲和层析法等）、等点聚焦等方法提取天然水蛭素。

2、仿生锈导法：仿生锈导法即指用仿生诱导的方法对活体水蛭进行诱导，从而得到水蛭素的一种方法。

它避免了传统方法对水蛭的一次性掠杀，既保护了水蛭的野生资源，又带动了水蛭养殖业的发展，为水蛭素的产业化提供了理论基础。

具体方法是：将日本医蛭在充氧条件下饥饿一周，再利用猪血与螺类混合做成的诱导体系，在25℃，PH7.2的条件下对其进行诱导30分钟，使其分泌唾液（即天然水蛭素粗品，其杂质比常规方法提取的减少了90%，且不影响水蛭素的提取率），然后将唾液进一步分离纯化制得天然水蛭素。

这是对天然水蛭素传统提取领域的一次革命，它既不杀死水蛭，又可反复利用，且在分离纯化过程中减少了水-丙酮的萃取或乙醇分级沉淀等工序，操作简单、方法独特，明显降低了生产成本，从而使天然水蛭素的规模化生产变为现实。

水蛭精粉（蚂蟥精粉）Shuizhi Jingfen【来源】本品为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania ac ranulata Whitman的新鲜活体的干燥粉末。

【加工炮制】取鲜水蛭，去除杂质，低温干燥，粉碎。

【性状】本品为灰白色至深灰色粉末。

味苦、微腥。

【鉴别】取本品lg，加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。

另取水蛭对照药材lg，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B ）试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。

【检査】水分不得过14.0% （中国药典2010版一部附录ⅨH第一法）。

总灰分不得过12.0%（中国药典2010版一部附录ⅨK ）。

酸不溶性灰分不得过3.0% （中国药典2010版一部附录ⅨK ）。

酸碱度取本品约lg，加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，取上清液，照pH值测定法（中国药典2010版一部附录Ⅵ G）测定，应为4.5~6.5。

外观均匀度取本品适量，置光滑纸上，平铺约5cm2，将其表面压平，在明亮处观察，应色泽均匀，无花纹与色斑。

微生物限度细菌数不得过10000cfu/g；霉菌和酵母菌数不得过100cfu/g；大肠菌群不得过100个/g；大肠埃希菌每g不得检出；沙门菌每10g 不得检出。

【浸出物】照醇溶性浸出物测定法（中国药典2010版一部附录Ⅹ A）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于15.0%。

【含量测定】取本品约lg，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100µl ，置试管（8mm×38mm ）中，加入含0.5% （牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1]（临用配制）200µl ，摇匀，置水浴中（37℃±0. 5℃）温浸5分钟，滴加每lml 中含40单位的凝血酶溶液[注2]（每1分钟滴加1次，每次5µl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（水蛭）或滴加每lml 中含10单位的凝血酶溶液[注2]（每4分钟滴加1次，每次2µl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（蚂蟥、柳叶蚂蟥），记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：2211V C V C U 式中 U —每lg 含凝血酶活性单位，U/g ；C 1—凝血酶溶液的浓度，µ/ml ；C 2—供试品溶液的浓度，g/ml ；V 1—消耗凝血酶溶液的体积，µl ；V 2—供试品溶液的加入量，µl 。

产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。

仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。

试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。

溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。

2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。

3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。

分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。