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酵母单杂交（yeast one hybrid）技术酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋⽩质相互作⽤的⼀种⽅法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋⽩基因，或对DNA结合位点进⾏分析。
运⽤此技术，能筛选到与DNA结合的蛋⽩质，并可直接从基因⽂库中得到编码该蛋⽩质的核苷酸序列，⽽⽆需复杂的蛋⽩质分离纯化操作，故在蛋⽩研究中，具有⼀定的优势；⽽且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，⽐其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。
1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展⽽来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进⾏检测以实现对蛋⽩质间相互作⽤的研究，⽽酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋⽩之间的相互作⽤，以研究真核细胞内的基因表达调控。
⽬前认为真核⽣物的转录起始，需要转录因⼦的参与。
这些转录因⼦通常由⼀个DNA特异性结合功能域和⼀个或多个与其他调控蛋⽩相互作⽤的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。
⽤于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋⽩即是⼀种典型的转录因⼦。
研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有⼏个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);⽽转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因⼦TFIID相互作⽤，提⾼RNA聚合酶的活性。
在这⼀过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独⽴地发挥作⽤。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋⽩，只要它能与我们想要了解的⽬的基因相互作⽤，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从⽽启动对下游报告基因的转录。
正是基于这⼀理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将⽂库蛋⽩⽚段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA⽂库质粒；(2)含有⽬的基因和下游报告基因的报告质粒。
分子生物学知到章节测试答案智慧树2023年最新山东农业大学第一章测试1.格里菲斯转型实验得出了什么结论（）参考答案:DNA是生命的遗传物质，蛋白质不是遗传物质2.现代遗传工程之父Paul Berg建立了什么技术（）参考答案:重组DNA技术3.下列哪种技术可以用于测定DNA的序列（）参考答案:双脱氧终止法4.RNA干扰是指由单链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
（）参考答案:错第二章测试1.比较基因组学是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。
（）参考答案:对2.以下哪项是原核生物基因组的结构特点（）参考答案:操纵子结构3.细菌基因组是（）参考答案:环状双链DNA4.下列关于基因组表述错误的是（）参考答案:真核细胞基因组中大部分序列均编码蛋白质产物5.原核生物的结构基因多为单顺反子，真核生物的结构基因多为多顺反子。
( )参考答案:错6.病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。
( )参考答案:对第三章测试1.在原核生物复制子中以下哪种酶除去 RNA 引发体并加入脱氧核糖核苷酸？（）参考答案:DNA 聚合酶 I2.使 DNA 超螺旋结构松驰的酶是（）。
参考答案:拓扑异构酶3.从一个复制起点可分出几个复制叉？（）参考答案:24.所谓半保留复制就是以 DNA 亲本链作为合成新子链 DNA 的模板，这样产生的新的双链 DNA 分子由一条旧链和一条新链组成。
( )参考答案:对5.DNA 的5′→3′合成意味着当在裸露3′→OH 的基团中添加 dNTP 时，除去无机焦磷酸 DNA链就会伸长。
( )参考答案:对第四章测试1.对RNA聚合酶的叙述不正确的是（）。
参考答案:全酶不包括ρ因子2.原核生物RNA聚合酶识别启动子位于（）。
参考答案:转录起始位点上游3.增强子与启动子的不同在于（）。
参考答案:增强子与转录启动无直接关系4.启动子总是位于转录起始位点的上游。
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
在所有的生命活动中，蛋白质是最终的执行者和体现者，并且随着大量生物基因组测序的完成，越来越多的研究人员将重点转移到蛋白组的研究上［１］。
而酵母单杂交技术是新近发展起来的一种体外研究ＤＮＡ与蛋白质相互作用的技术。
众所周知，在生物体内ＤＮＡ与蛋白质间相互作用的表达调控机制是非常普遍的，且具有重要的生物学功能。
比如在基因转录和复制中都存在这种调控机制，因此目前酵母单杂交技术已经被广泛地应用于科学研究的各个领域。
１酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术最早是１９９３年由Ｗａｎｇ和Ｒｅｅｄ创立的［２］，其理论基础是：许多真核生物的转录激活因子均具有２个功能上独立的结构域———ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎＢＤ）和ＤＮＡ激活结构域（ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎＡＤ），前者特异结合于顺式作用元件上，后者实施基因表达调控功能［３－４］，因此ＤＮＡ结合结构域和ＤＮＡ激活结构域就可以分开使用，单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。
酵母单杂交技术就是利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白，只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的ＤＮＡ序列结合，也就是说它能够扮演转录因子结合结构域的功能，那么就会形成有功能的转录因子，从而实施基因表达调控，激活启动子下游报道基因的表达。
人们用于酵母单杂交系统的酵母ＧＡＬ４蛋白即是一种典型的转录因子。
２酵母单杂交技术的操作步骤在实验过程中，首先要将报告质粒、文库和融合表达质粒同时转入酵母报告株，若文库所表达的某些蛋白能与设定的特异ＤＮＡ序列相结合，则这些融合蛋白就具有转录因子的活性，能够激活与顺式作用元件相连的最小启动子，使下游报道基因得以表达，并使酵母细胞在相应的ＳＤ缺陷性培养基上生长，并能对３－ＡＴ产生抗性［５－６］，然后提取报道基因表达的克隆株的质粒，转入大肠杆菌进行测序就可以获得这些蛋白（即能与特异ＤＮＡ序列相结合的蛋白）的ＤＮＡ序列。
第一章测试1.现代分子生物学在研究对象、研究策略和研究内容上都发生了很大转变。
其中“组学”的诞生，标志着“还原论”向“系统论”的转变。
（）A:对B:错答案:A2.分子生物学研究的是中心法则每一步的分子机理。
（）A:错B:对答案:B第二章测试1.核苷酸是由含氮碱基、五碳糖和三磷酸集团三部分构成。
（）A:错B:对答案:B2.原核生物的基因组有以下特点（）。
A:有内含子B:有重复序列C:有重叠基因D:存在转录单元E:建构简练答案:CDE3.构成RNA的单体是核糖核苷酸，RNA没有DNA稳定，通常以单链形式存在。
（）。
A:错B:对答案:B4.真核生物染色体结构的基本单位是核小体，是由八聚体组蛋白核心和缠绕其上的DNA构成。
（）A:错B:对答案:B5.DNA聚合酶Ⅲ中，起核苷酸聚合作用的亚基是（）。
A:ɑ亚基B:θ亚基C:β亚基D:ω亚基答案:A6.与原核生物相比，真核生物的DNA复制具有以下特点（）。
A:复制机理主要由细胞周期来协调B:复制起点没有统一的碱基序列C:复制原点有统一的碱基序列D:多起点复制E:复制速度慢答案:ABDE7.在点突变中，一个嘌呤被一个嘧啶取代或一个嘧啶被另一个嘌呤取代叫转换。
（）A:对B:错答案:B8.点突变的后果由沉默突变、错义突变和无义突变三种。
（）A:对B:错答案:A9.不正确配对的正常碱基由错配修复机制修复，化学修饰过的核苷酸或碱基则通过核苷酸切除修复或碱基切除修复机制完成修复。
（）A:对B:错答案:A第三章测试1.RNA聚合酶 II 是转录核糖体的RNA。
（）A:对B:错答案:B2.增强子的作用具有细胞或组织的特异性。
（）A:对B:错答案:A3.转录时，RNA链的延伸方向为5’—3’；转录起点用数字0表示。
（）A:对B:错答案:B4.所有tRNA都需要加工。
（）A:对B:错答案:B5.真核细胞mRNA前体的长度由（）。
A:在终止位点与RNA聚合酶II结合的终止蛋白决定。
生命科学系本科2010—2011学年第1学期试题分子生物学（A）答案及评分标准一、选择题,选择一个最佳答案（每小题1分,共15分）1、1953年Watson和Crick提出（A ）A、多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋B、DNA的复制是半保留的，常常形成亲本——子代双螺旋杂合链C、三个连续的核苷酸代表一个遗传密码D、遗传物质通常是DNA而非RNA2、基因组是（D )A、一个生物体内所有基因的分子总量B、一个二倍体细胞中的染色体数C、遗传单位D、生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量3、下面关于DNA复制的说法正确的是（D )A、按全保留机制进行B、按3＇→5＇方向进行C、需要4种NTP加入D、需要DNA聚合酶的作用4、当过量的RNA与限量的DNA杂交时（A ）A、所有的DNA均杂交B、所有的RNA均杂交C、50%的DNA杂交D、50%的RNA杂交5、以下有关大肠杆菌转录的叙述，哪一个是正确的？（B ）A、—35区和—10区序列间的间隔序列是保守的B、—35区和-10区序列距离对转录效率非常重要C、转录起始位点后的序列对于转录效率不重要D、-10区序列通常正好位于转录起始位点上游10bp处6、真核生物mRNA转录后加工不包括（A ）A、加CCA—OHB、5＇端“帽子”结构C、3＇端poly（A)尾巴D、内含子的剪接7、翻译后的加工过程不包括（C ）A、N端fMet或Met的切除B、二硫键的形成C、3＇末端加poly（A)尾D、特定氨基酸的修饰8、有关肽链合成的终止，错误的是( C ）A、释放因子RF具有GTP酶活性B、真核细胞中只有一个终止因子C、只要有RF因子存在,蛋白质的合成就会自动终止D、细菌细胞内存在3种不同的终止因子：RF1、RF2、RF39、酵母双杂交体系被用来研究( C ）A、哺乳动物功能基因的表型分析B、酵母细胞的功能基因C、蛋白质的相互作用D、基因的表达调控10、用于分子生物学和基因工程研究的载体必须具备两个条件（B ）A、含有复制原点，抗性选择基因B、含有复制原点,合适的酶切位点C、抗性基因，合适的酶切位点11、原核生物基因表达调控的意义是( D ）A、调节生长与分化B、调节发育与分化C、调节生长、发育与分化D、调节代谢，适应环境E、维持细胞特性和调节生长12、乳糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是( E ）A、与DNA结合影响模板活性B、与启动子结合C、与操纵基因结合D、与RNA聚合酶结合影响其活性E、与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNA13、Lac阻遏蛋白由（D )编码A、Z基因B、Y基因C、A基因D、I基因14、紫外线照射引起DNA损伤时，细菌DNA修复酶基因表达反应性增强，这种现象称为（A ）A、诱导B、阻遏C、正反馈D、负反馈15、ppGpp在何种情况下被合成？（A ）A、细菌缺乏氮源时B、细菌缺乏碳源时C、细菌在环境温度太高时D、细菌在环境温度太低时E、细菌在环境中氨基酸含量过高时二、填空题（每空1分，共10分）1、某双链DNA分子中,A的含量为15%,则C的含量是35％。
酵母双杂交的原理及其在分子生物学研究中的应用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可用于研究蛋白质相互作用、酵母遗传学以及药物筛选等领域。
本文将分为两个部分，首先介绍酵母双杂交的原理和方法，然后探讨其在分子生物学研究中的应用。
一、酵母双杂交的原理和方法酵母双杂交技术是通过构建一个人工的酵母表型来研究蛋白质间相互作用的技术。
其基本原理是利用转录因子的激活域和DNA结合域分离为两半，并将这两半与待测蛋白结合，从而使转录因子重组并激活报告基因的表达。
具体而言，酵母双杂交实验需要构建三个关键的DNA重组元件：酵母表达载体、效应报告基因和测试蛋白质。
1.1 酵母表达载体：酵母表达载体是一个质粒，其中包含两个重要的部分，即酵母选择性培养基选择基因和转录因子的激活域和DNA结合域。
1.2 效应报告的基因：效应报告基因可用于检测蛋白质相互作用的程度。
一般选择具有报告基因（如lacZ、GFP）的启动子和结构基因的基因组片段。
1.3 测试蛋白质：待测蛋白质需要与转录因子的激活域和DNA结合域相互作用。
测试蛋白可以来自多种来源，如细菌、动物或植物。
在酵母双杂交实验中，测试蛋白质片段被融合到转录因子激活域的N端，而其他可能相互作用的蛋白质片段被融合到DNA结合域的C端。
当这两个蛋白质结合后，转录因子就会再组装成一个功能完整的转录因子，从而激活效应报告基因的表达。
可以通过测定报告基因的表达水平来推测蛋白质之间的相互作用程度。
二、酵母双杂交在分子生物学研究中的应用2.1 研究蛋白质相互作用：酵母双杂交是研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具。
通过构建不同蛋白质的基因库，可以筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质，进而揭示细胞内蛋白质网络的结构和功能。
2.2 酵母遗传学研究：酵母双杂交还可以用于酵母遗传学的研究。
通过构建与酵母突变株相互作用的蛋白质基因库，可以筛选出与突变株互补的基因，从而揭示酵母基因功能和调控网络。
2.3 药物筛选：酵母双杂交技术可以应用于药物筛选，特别是针对蛋白质相互作用靶点的药物开发。
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。
编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。
缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。
如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。
Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。
2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
分子生物学-11(总分：100.01，做题时间：90分钟)一、问答题(总题数：20，分数：100.00)1.简述增强子的作用特点。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：①增强子可以发挥远程作用(1～4kb)，增强同一条DNA链上基因转录效率；②增强子作用与其序列的正反方向无关，在基因的上游或下游都能起作用；③增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录；④增强子一般具有组织或细胞特异性。
2.什么是沉默子，简述其用特点。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：沉默子是一种抑制基因表达的顺式作用元件。
沉默子可以远程调控基因的转录作用，且无位置和方向依赖性，具有组织特异性。
沉默子可能引起染色质弯曲缠绕，产生异染色质结构，导致基因处于失活状态。
3.真核生物mRNA仅是细胞总RNA的一小部分(质量的3%)左右，解释可能的原因。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：总RNA中还包含大量的rRNA和tRNA，rRNA是核糖体的重要组成部分，一系列的tRNA是翻译必不可少的分子群。
另外，mRNA半衰期只有1～24小时。
因此mRNA的量比其他RNA的量要少。
4.为什么rRNA和tRNA分子比mRNA更稳定?（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：mRNA以单链形式存在于细胞中，能被特异的单链RNA酶识别并降解。
