3抗体筛选操作步骤

目录1、输血前检测实验程序2、改良低离子聚凝胺法实验操作规程3、冰箱维护程序4、ABO 血型鉴定5、Rh（D）血型鉴定6、抗体筛选和鉴定试验7、临床自体输血标准操作规程8、冰冻血浆溶化操作规程输血前检测实验程序1、实验要求血清和血浆都可以用于交叉实验和抗体检测，最好是血清标本，标本使用限制在 3 天内，含有肝素等抗凝标本可以用凝血酶或硫酸鱼精蛋白处理使其凝集析出血清。

允许通过静脉输液口采集标本，但必须丢弃受残留静脉输液影响的5ml标本。

一般不允许使用溶血标本，对急性溶血性贫血和烧伤病人的溶血标本，在实验前后必须做溶血程度的比较。

标本和输血申请单上的所有资料必须填写清楚并完全符合，否则应重抽标本。

对所有用过的献血员和受血者标本必须在1-6℃冰箱至少保存7 天，所有实验都必须保证观察和记录同时进行，且记录和资料都必须至少保存 5 年。

2、血型检测要求完成病人ABO 正反定型、Rh（D），献血员血型ABO 正定型（必要时做Rh 血型），D 阴性病人必须做Du 实验确定。

3、交叉试验3.1 受血者交叉配血时所用的标本必须是输血前 3 天之内的。

3.2 配血时要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO 血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型（急诊抢救患者紧急输血时Rh（D）检查除外），正确无误时可进行交叉配血。

3.3 凡是输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩红细胞、手工分离浓缩血小板等患者，应该进行交叉配血试验。

机器单采浓缩血小板、冷沉淀、新鲜血浆应与ABO 血型同型输注。

3.4 凡遇有下列情况时必须按《全国临床检验操作规程》要求完成凝聚胺交叉试验和检测不完全抗体的交叉试验（酶法、聚凝胺法、抗人球蛋白法）。

除紧急输血和自身输血外，所有输入红细胞的其他制品均要求做血交叉试验。

3.5 其他试验另外必须开展的试验有抗人球蛋白试验，抗体筛选、抗体鉴定、新生儿溶血病的全套实验。

ABO疑难血型三步分析法在血型分类中没有疑难血型,迄今为止在文献中也查不到“疑难血型”的定义，因为“疑难血型”是1种血型难以检定或判定的“现象”,而不是1种型别。

检定1份标本是否属“疑难血型”，除了标本本身的特殊性外，还与实验室的设备、技术人员的水平、经验等多种因素有关，例如1份ABO亚型标本,在基层医院血库可能因为正定型与反定型不一致而分析不出原因被认为是“疑难血型”,但在血液中心血型参比实验室该问题可能就易于迎刃而解。

在检定血型时,标本如果受多种因素干扰使结果难以判定,便呈现“疑难血型”现象。

一、干扰ABO血型正确判定的因素（一）生理性因素1.年龄老年人(ABO抗原或ABO抗体减弱),6个月前的婴儿(ABO 抗原或ABO抗体不成熟),可能导致ABO血型误定。

2.ABO亚型包括A(B)型、B(A)型,ABO抗原减弱导致细胞定型(正定型)受干扰,或血清中出现不规则抗体干扰血清定型(反定型)。

3.冷凝集素有些健康人血清中含有冷凝集素,且在<4℃才有活性,不干扰ABO血型检定,如果冷凝集素效价升高,或在室温以上反应,致敏自身红细胞可能干扰ABO正定型,存在于血清可能干扰ABO反定型。

4.“先天性”无ABO抗体近年有“先天性”无ABO抗体的个案报告,原因有待研究。

5.双精子授精红细胞呈嵌合体。

6.个体特异性个别人血清中ABO可溶性血型物质过高,ABO正定型红细胞凝集减弱。

（二）实验技术原因1.标本混淆如采错被检者,红细胞和血清非同一人,记录结果与标本编号不对应。

2.静脉输液处采样ABO抗体被输液稀释,干扰ABO反定型。

3.采样不规范用凝血块洗下红细胞检定血型，其中混有凝集程度不一的红细胞；用血浆做ABO反定型,操作过程中纤维蛋白析出凝集试剂红细胞。

4.试剂质量问题或漏加试剂定型试剂过期失效，未达标准，被污染。

操作中未遵循“先加血清后加细胞”的原则，大批量样本试验时漏加试剂血清或试剂红细胞。

5.实验操作不规范被检红细胞未洗涤,非特异性粘附血浆蛋白,或被检红细胞悬液过浓或过稀。

输血科红细胞血型抗体筛查标准操作规程红细胞血型抗体筛查标准操作程序红细胞血型抗体检查适用于下列情况：1．ABO血型鉴定发现受检者血清中有ABO血型以外的抗体时；2．供血者血清抗体筛检；3．输血前受血者血清抗体检查；4．输血后溶血性输血反应疑为由同种抗体引起时；5．孕妇血清的抗体检查；6．新生儿溶血病婴儿血液中抗体检查；7．直接抗人球蛋白试验阳性红细胞上抗体检查。

筛查方法一、盐水介质法：【方法原理】有些抗体能凝集盐水混悬的红细胞。

这些抗体通常是IgM类抗体，其中许多在22℃下反应最好。

在室温下有活性而在37℃无活性的抗体是没有什么临床意义的。

对患者或供血者的血样不需要用这种方法。

在37℃下也有活性的样本(如抗Kell，抗D)是有临床意义的，而这些抗体通常可用抗人球蛋白试验和酶技术来检查。

【试剂】1．试剂红细胞：由血型参比实验室或血液中心提供，或由各血库从供血者或工作人员中进行普查得到。

筛查红细胞以2个或3个人抗原互补的不同的红细胞为1套，单独分开分装，因为单一的筛查红细胞较混红细胞提供较高的敏感性。

因为许多抗体同双倍量抗原(纯合子)的红细胞反应比同单倍量抗原(杂合子)的红细胞反应要强得多，而不可能得到的都是纯合子红细胞，因此，筛查红细胞的抗原组成必须是互补，经提供尽可能多的必要的抗原。

筛查红细胞大多不包括低频率抗原，所以不可能检出低频率抗体。

这种抗体只有在抗体鉴定时被测到，或在交叉配血时被发现，或在新生儿出生后出现黄疽时被发现。

每一组筛查红细胞中至少有常见的抗原，而且是互补的。

如果某种抗体只能与一种特定抗原的纯合子细胞起反应，而筛查红细胞上这种特定抗原是杂合子，则该抗体可能被漏检。

合适的纯合子表现型的供血者是很少的，为了提供有重要抗原的纯合子细胞，需要使用来自3个供血者的红细胞。

2．血清标本：虽然血清和血浆中存在相同的红细胞抗体，但一般都采用血清进行抗体检查。

因为：①如果血浆中的凝血系统发生部分激活，就可产生纤维蛋白，干扰对凝集的解释；②只有通过激活补体的作用才能证实的抗体，不能在血浆中检出；③常用的抗凝剂是结合Ca2+来防止凝固，而Ca2+对于补体的激活是必不可少的。

高中生物课本中“抗体”知识的梳理本专题以抗体为出发点，联系了高中教材中多个章节的知识点，如免疫、遗传的物质基础、生物膜系统及细胞工程、动物代谢知识等。

以该知识点为专题进行复习，不仅可以进一步熟知教材中的相关知识点，加强对课本知识的横纵向联系，使知识更加系统化，而且对于培养分析、综合、应用等能力有一定的帮助。

一、知识体系：二、知识解析：（一）抗体的定义：●产生：抗体是机体受到抗原刺激后产生的●特性：能与该抗原发生特异性结合●功能：具有免疫功能●化学本质：球蛋白（可用双缩脲试剂进行鉴定，产生紫色反应）（二）抗体的结构：组成抗体的基本元素是C、H、O、N等，由各种化学元素组成基本单位――氨基酸，各种氨基酸通过缩合方式形成肽链，抗体是由4条肽链构成的蛋白质，4条肽链通过一定的化学键连接，再折叠、盘曲形成的空间结构就是抗体。

（三）抗体的合成与分泌：1．抗体是分泌蛋白，其合成及分泌是在体液免疫的反应阶段进行的，合成部位是在效应B细胞内的粗面内质网上的核糖体上，与其合成及分泌相关的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体、线粒体（注意掌握各细胞器所起的作用）；其合成及分泌的途径是：核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜→胞外，分布到血清、组织液、外分泌液（如唾液、泪、尿、乳汁等）中；该物质出细胞的方式为外排作用。

2．抗体的合成要受到相应基因的控制，控制其合成的基因为真核细胞基因，其结构包括编码区和非编码区，非编码区对编码区的表达起调控作用，编码区包括内含子和外显子。

3．基因控制抗体的合成包括转录和翻译过程。

（场所、原料、条件、过程等）1．定义：由单个B细胞经多次无性繁殖（即克隆）形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体（特点）。

2．相关技术手段：动物细胞融合、动物细胞培养3．制备过程：详见本文第一部分“知识体系”注：在单克隆抗体的制备中要涉及到两次筛选，两次筛选的目的是不同的：（1）第一次筛选：B淋巴细胞在与骨髓瘤细胞融合后可得到三种类型的融合细胞，即B淋巴细胞与B淋巴细胞融合成的融合细胞、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合成的融合细胞，第一步筛选的目的是从三种融合细胞中把杂交瘤细胞筛选出来。

免疫组化操作步骤一免疫组化（LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2.缓冲液洗 3min/2 次。

3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4.缓冲液洗 5min/2 次。

5.滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。

）6.缓冲液洗 5min/2 次。

7.滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8.缓冲液洗5min/2 次。

9．滴加Primary Antibody Enhancer（增强子） , 在室温下孵育20 分钟。

10．缓冲液洗5min/2 次。

11．滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30 分钟。

（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12．缓冲液洗5min/2 次。

13．向1ml DAB Plus Substrate （或AEC Plus Substrate）中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）, 混匀后滴加到切片上，孵育3 －15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）14．自来水充分冲洗, 复染，脱水, 透明, 封片。

二．免疫组化（三步法）操作步骤：（1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（2 ）、3%H 2 O 2 室温孵育5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3 ）、蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 分钟x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（4 ）、5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育10 分钟，倾去血清，勿洗。

HIV测定（ELISA法）标准操作规程1、检验目的应用双抗原夹心酶联免疫法原理（ELISA）定性检测人血清、血浆标本中的HIV（1+2）型抗体的测定，用于HIV感染的辅助诊断，抗HIV药物治疗的效果的监测。

2、原理采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV （1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。

通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。

3、性能参数灵敏度高（0.5ng/ml）4、标本要求（1）标本类型：血清，血浆。

（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，2-8℃不超过72小时，-20℃可长期保存，应避免反复冻融（4）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。

本文来自检验地带网5、容器和添加剂类型6、试剂（1）试剂名称：人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒。

（2）试剂生产厂家：上海科华生物工程股份有限公司（3）包装规格：96T/Kit（4）试剂盒组成：①、HIV酶标板；②、HIV酶标试剂；③、HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；④、显色剂A液和B液；⑤、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。

7、仪器设备：酶标仪：ZS板式，北京普朗生物技术有限公司，每年由计量单位进行一次校准。

洗板机：DNM-9620型，北京普朗生物技术有限公司，每年由国家计量单位进行一次校准。

移液器：上海求精，每年由国家计量单位进行一次校准。

8、校准程序9、操作步骤①、配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。

②、编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。

③、加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。

新生儿溶血病血清学检查操作规程原理新生儿溶血病是由母婴血型不合引起，可见于ABO、Rh及MN等血型系统。

胎儿和新生儿红细胞被来自母亲的IgG抗体包被，并在婴儿的单核-巨噬细胞系统（网状内皮系统）受到免疫性破坏，出现溶血，表现出相应的症状。

病情严重程度因个体差异、抗体类型、抗体效价等不同而异。

目的规范新生儿溶血病血清学检查操作；查找新生儿溶血病发生的原因，协助临床进行实验室诊断及治疗；保证临床用血的安全性和有效性。

职责输血科技术人员负责新生儿溶血病血清学检查。

适用范围母婴血型不合引起的新生儿溶血病的血标本。

支持文件《中国输血技术操作规程》（血站部分）.天津：天津科学技术出版社1997《输血技术学》第2版.北京：人民卫生出版社，2002《输血科（血库）工作手册》莞市中心血站2006材料或设备1、材料抗-A、抗-D定型试剂、抗球蛋白试剂、ABO反定型试剂红细胞、筛选细胞、谱细胞、生理盐水、新生儿静脉血、产妇及患儿父亲血标本2、设备血清雪专用离心机、电热恒温水浴箱、水浴振荡仪、显微镜、小试管、滴管、小玻棒操作步骤一、血标本采集及处理采集患儿及其父亲与母亲血标本各3-5ml，分离出血清，配制3%-5%红细胞盐水悬液。

如果患儿血标本为不抗凝血，则在一小玻璃漏斗颈部置一适当大小的棉球上，一边加生理盐水，一边用玻棒挤压血块，收集漏斗下面的红细胞悬液。

二、患儿血标本具体操作执行《ABO和Rh血型鉴定操作规程》。

ABO血型测定只做正定型。

1、直接抗球蛋白试验具体操作执行《抗球蛋白操作试验规程》中的直接抗球蛋白试验部分。

2、游离抗体检测⑴、取小试管3支，分别标明A、B、O细胞，每管加患儿血清2滴，再分别加入3%-5%的A、B、O、反定型试剂红细胞悬液1滴。

⑵、37℃致敏1h后取出，若发生凝集，不必继续往下做。

⑶、若不凝集，用盐水充分洗涤3次反应物后加入抗球蛋白血清1滴。

1300g离心15s，轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集反应，记录结果。