生物工程下游技术复习资料

第1-4章1.生物工程的基本过程。

2.生物反应器:各种细胞及其代谢产物的生产过程都要通过细胞的培养，而细胞的培养所用的装置就是生物反应器。

3.动物细胞培养方式。

贴壁培养、悬浮培养、固定化培养第五章⒈目标产物分离纯化路线包括哪两个基本阶段？产物的初级分离、产物的纯化精制⒉细胞破碎按照是否存在外加作用力可分为哪两类？每类中有哪些常见类型？机械法和非机械法。

机械法：高压匀浆法、高速珠磨法非机械法：化学渗透法、酶溶法⒊高压匀浆法破碎细胞的作用机理是什么？要提高破碎率可采取什么办法？该法温控与能耗如何？存在的主要问题是什么？机理：从高压室压出的细胞悬浮液经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。

这种高速喷出的浆液又射到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出，细胞经过一系列的高速流的剪切、碰撞、以及从高压到常压的变化。

使细胞产生较大的形变，导致细胞壁的破坏。

方法：增加压力或增加破碎次数能耗：能耗主要包括提供动力消耗的能量以及低温操作消耗的能量。

存在问题：较易造成堵塞的团状或丝状真菌以及较小的革兰氏阳性菌不适合用此法⒋高速珠磨法破碎细胞的作用机理是什么？该法温控与能耗如何？微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的相互剪切碰撞，使细胞壁破裂，释出内含物。

能耗：采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能够将温度控制在要求范围内。

能耗与细胞破碎率成正比。

⒌比较高压匀浆法和高速珠磨法的特点。

高压匀浆法：操作参数少，易于确定。

高速珠磨法：操作参数多，一般凭经验估计。

⒍超声破碎机理及存在的问题分别是什么？机理：声频高于15—20KHz的超声波在高强度声能输入可以进行细胞破碎，其破碎机理尚未弄清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，空化现象是强声波作用下，让气泡形成，胀大和破碎的现象。

存在问题：超声波产生的化学自由基能使某些敏感活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置声能传递，散热均有困难。

⒎何谓化学渗透法？其作用机理是什么？该法常用的化学试剂有哪几类？该法与机械法比较有何优缺点？某些有机溶剂抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性的渗透出来。

类型：EDTA作为螯合剂、甲苯（有机溶剂）、Trition X-100（非离子型清洁剂）优点：1、对产物释出具有一定的选择性2、细胞外形保持完整，碎片少，利于后分离3、核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取缺点：1、时间长，效率低2、化学试剂具有毒性3、通用性差⒏何谓酶溶法？其作用机理是什么？该法有何优缺点？用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。

机理：具有高度的专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡萄糖酶只能对葡萄糖有作用，因此溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。

优点：选择性释放产物，核酸泻出少，细胞外形完整缺点:价格高，通用性差⒐细胞破碎技术研究的发展方向是什么？1、多种破碎方法相结合2、与上游过程相结合3、与下游过程相结合⒑什么是包含体？人工进行细胞破碎来释放产物，而且相当多的蛋白质产物在胞内凝集成没有活性的固体颗粒11.蛋白质复性方法有哪些？稀释复性和透析复性色谱复性凝胶过滤复性金属螯合色谱复性亲和色谱复性12.离心分离的原理是什么？离心沉降速度受哪些因素影响？按分离因素大小离心分哪几类？原理：固体和液体之间的密度差影响因素：密度差、固体颗粒尺寸、液体黏度、离心力分类：低速离心、高速离心、超速离心13. 何谓切向流过滤？一种维持恒压下高过滤速度的技术14. 何谓双水相萃取？利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法第六章1.膜分离技术有何优点？设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高、节省能量2.膜分离技术有哪些常见类型？分离原理分别是什么？微滤：利用筛分原理分离，截留直径为0.05—10um大小粒子的膜分离技术超滤：筛分原理，但在有些情况下受到粒子荷电性及其与核膜相互作用的影响反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中大分子、小分子有机物级无机盐全部被截留住电渗析：阴阳离子交换膜被交替排列在正负极之间形成许多独立的小单元渗透蒸发：利用膜与被分离有机液体混合物中各组分的亲和力不同而有选择的优先吸附溶液某一组分及各组分在膜中扩散速度不同来达到分离目的3.膜按荷电性和亲疏水性分别分为哪些类型？荷电性：中性膜、荷电膜亲疏水性：亲水膜、疏水膜4.什么是浓差极化？在分离过程中，料液中的溶剂在压力的驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高5.什么是膜污染？控制膜污染要注意哪些方面？处理物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象6.膜清洗方法有哪些？物理方法：高速流水冲洗、海绵球机械擦洗、反洗化学方法：化学清洗剂（稀碱、烯酸、酶、表面活性剂、络合剂、氧化剂）第七章1.依据分离时一次进样量的多少色谱分为哪些类型？分析色谱、中等规模制备色谱、工业生产规模色谱2.计量置换保留理论的核心是什么？该理论不适用于哪种色谱？核心：当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子不适用反相高效液相色谱3.何谓有效柱长？何谓最短柱长？有效柱长：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离成为有效迁移距离，也成为有效柱长。

最短柱长：混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短长度。

4.色谱装置均包括哪几部分？流动相供给、进样、色谱柱、检测器5.色谱过程中洗脱方法有哪两种？常用的梯度是什么？梯度洗脱方式有哪两种？方法：等梯度洗脱法、梯度洗脱法常用浓度梯度浓度梯度和PH梯度洗脱6.如何进行色谱纯化工艺的最优化？7.比较各种色谱复性方法。

8.影响色谱复性的因素有哪些？流动相的组成、温度、PH第八章1.色谱法的基本特点有哪些？分离效率高、应用范围广、操作参数多、高灵敏在线检测、快速分离、连续自动化操作2.什么是线性色谱、非线性色谱？二者色谱行为有哪些根本不同？线性色谱：在色谱学中，如果流动相中样品的浓度与固定相中样品的浓度之间呈线性关系，那么在这种情况下的色谱分配过程就称为线性色谱。

非线性色谱：在色谱学中，如果流动相中样品的浓度与固定相中样品的浓度之间不存在线性关系，而是出现其他的函数关系，那么相应的色谱分离过程就称为非线性色谱。

不同：1、样品保留值不同2、峰形的不对称性3、色谱峰的峰高与浓度不是线性3.何谓吸附等温线？凸形、凹形吸附等温线对应的色谱峰分别是什么形状？吸附等温线：是指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程，达到平衡时他们在两相中浓度之间的关系。

凸形产生拖尾的峰形凹形具有伸舌头峰形4.选择色谱柱长度、柱径分别要考虑什么因素？5.柱填充主要有哪两种方法？干法和湿法6.制备合适的样品溶液要注意哪些问题？目前进样方法有哪些？保证大量样品溶液能均匀分布在柱的截面上，使轴向扩散及局部超载降至最小1、采用带样品管的六通进样阀2、用高压泵直接输送样品进入色谱柱7.什么是超载洗脱、前沿分析、置换展开？各有何优缺点？超载洗脱：样品在固定相上的负载超过了线性洗脱色谱的容量优点：易于为色谱分析人员接受，只需从分析色谱条件加以适当的放大和修改即可用于制备洗脱缺点：样品在分离过程中不断稀释，增加后处理的工作量前沿分析：样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断的输入色谱柱，它本身起了色谱柱的作用优点：适合于浓缩痕量组分，使之进一步分离和纯化，也适合与产品的精制置换展开：样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力很强的流动相通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子优点：样品中各组分的浓度在展开过程中不但不会降低，有时甚至还能提高缺点：不易找到合适的置换剂8.如何选择合适的展开方式？选择什么方式取决于样品的性质、所需的产品纯度及要求的产率第九章1.凝胶过滤有何优点？该法有何主要用途？1、分离条件温和，蛋白质不易变性，收率高，重现性好2、工作范围广，分离分子量的覆盖面积大3、设备简单，易于操作，周期短用途：脱盐和分级分离2.凝胶过滤介质应具备哪些条件？1、介质本身为惰性物质，在应用过程中它不与溶质、溶剂分子发生任何作用2、应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异吸附性，提高蛋白质的收率3、介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄4、凝胶珠粒大小均匀，即粒径的均一性好5、介质要具有优良的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒以增加使用寿命3.凝胶过滤应注意哪些事项？将搅拌均匀的凝胶匀浆一次性倒入柱中，不能产生分层现象4.葡聚糖凝胶性能如何？溶胀性好，化学性质稳定、物理性质稳定、机械强度取决于交联度5.琼脂糖凝胶有哪些代表性类型？性能如何？Bio-Gel A系Sepharose 性能详细见p1686.离子交换剂功能基组成如何？功能基由固定在骨架上的带电基团和可进行交换的能移动离子组成7.何谓正吸附、负吸附？正吸附：将目的产物离子化，被交换到介质上，杂质不被吸附而从柱流出负吸附：将杂质离子化后被交换，而目的产物不被交换直接流出8.离子交换法按操作方法分哪两种？间歇式分批操作和柱式操作9.生化用离子交换剂有何特点？亲水性和生物相容性、孔结构（兼有分子筛和离子交换双重作用）、电荷密度适当才有利于对生物大分子的分离纯化、粒径越小分布越均匀分离效果越好、纯度分多等级10.如何选择合适的离子交换剂？详见p17511.离子交换分离介质使用中应注意哪些问题？1、预处理除去在生产、包装过程中混入的杂质2、装柱介质在柱中分布均匀，尤其不允许有气泡存在，防止出现分层现象3、流速由于分子扩散速率较慢，不宜流速过快4、适当的洗脱和再生方式5、消毒及树脂的“复苏”第十章1.有机高分子类型填料有何特征？1、它们的基质微球可以广泛选择天然的多糖为原料来制备，也可以广泛使用各种合成的单体和交联剂来制备2、它们对于被分离样品有较强的负载能力3、它们具有良好的耐酸、耐碱、耐溶剂处理的化学稳定性4、它们不易产生不可逆的非特异性吸附作用2.常用液相色谱填料按物理形态可分为哪些类型？多孔型、非多孔型、薄壳型3.液相色谱填料化学结构要符合哪些要求？1、能在相应色谱模式的淋洗条件下，具有特定选择性分离作用的化学结构2、具有良好的化学稳定性和热稳定性3、能避免不可逆的非特异性吸附作用4.常见的有机高分子类型填料的基质树脂有哪两大类？各有哪些代表类型？多糖型和聚合物型多糖型：葡聚糖系凝胶、琼脂糖系凝胶聚合物型：交联聚苯乙烯树脂、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂5.表征填料物理性质的参数有哪些？评价填料的色谱参数有哪些？填料的骨架密度、溶剂吸收量Sr、溶胀因子f6.目前反相色谱填料以什么为主？该类填料有何特点？高分子基质的反相色谱填料有何特征？硅胶基质的键合相填料为主体特点：颗粒刚性好，有利于传质，可以得到很高的柱效，良好的选择性特征：具有烷基键合相那种非特性7.有机高分子类型IEC填料有哪些优越性？离子色谱的基本原理是什么？优越性：1、可在全程PH值范围内使用2填料使用寿命长3、填料普遍有较高的色谱容量4、填料的基质骨架结构，一般很少有非特异性吸附原理：建立在样品分子与固定相表面基团之间电荷相互作用的基础上8.疏水性相互作用色谱的分离原理是什么？该法有何特点？原理：依赖于溶质与填料表面之间弱的疏水性相互作用特点：1、可以避免使用含有大量有机溶剂的淋洗体系2、有效的保持被分离物质的生物活性9.SEC方法按淋洗体系通常分为哪两类？两者有什么区别？水相SEC和有机相SEC两种方法的分离原理是相同的，但柱填料及其分离对象和使用技术完全不同第十一章1.生物工程产品大规模制备分离所需色谱填料应当满足哪些条件？1、能达到所需的分离效率2、进行制备分离时，应不引起分离对象的变性或失活，有较高的回收率和负载量3、化学及机械性质稳定4、成本较低，价格合理2.色谱填料按形状划分有哪些？最主要和最通用的是什么填料？球形、无定型、膜以及纤维等不同形状最主要和最通用：球形和无定型填料3.无机基质色谱填料以什么为基本材料？其他无机基质材料有哪些？多孔硅胶为基本材料其它材料：可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、羟基磷灰石、碳和石墨4.用作分离介质的硅胶实质是什么？其有何特点？实质：人工合成的多空二氧化硅特点：表面含有丰富的硅醇基表面可以存在大量的物理吸附水5.硅胶表面硅羟基可能存在哪些类型？自由硅羟基和孤立硅羟基6.硅胶的化学性质如何？用于色谱时有何限制？化学性质稳定PH一般只能在PH2—8之间使用7.用作分离材料的硅胶物理性质如何？形状球形：利于传质，使柱子的操作压力较低孔：开放孔表面积：很大表面积孔度：孔度关系到样品在色谱柱上保留体积和分辨率，但孔度过大影响材料机械强大机械强度：高机械强度8.可控孔径玻璃制备原理如何？在热处理的过程中会发生相分离现象，生成可溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶于酸的高硅相，以酸处理的方法，将其中的酸可溶部分浸析出来，高硅相则存留下来，在这一过程中，Na2O-B2O3相所占的体积成为的孔隙，剩余的高硅相实质上是二氧化硅9.可控孔径玻璃有哪些特点？表面具有可以进行修饰与衍生的游离硅羟基机械强度高、孔径分布非常窄而均匀10.用作分离材料的氧化铝有何用途？有何局限性？主要用于小分子有机物的分离局限性:难以像二氧化硅那样通过键和而得到适应不同分离模式的固定相11.硅胶的化学修饰有哪几种方式？整体修饰、表面硅羟基的化学修饰、涂层法12.Si-O、Si-C、Si-N键分别有何特点？Si-O：对酸较稳定，但耐碱能力较差Si-C：对酸不稳定，当PH小于2时，易被破坏而导致所连接的官能团脱落Si-N：高反应活性使它不适应于含水试剂13.硅羟基的化学修饰可采用哪几种途径？氯化反应、通过氯硅烷与硅羟基的反应、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应14.“复合”分离材料结合了哪两方面的优点？高聚物的化学稳定性与硅胶等无机基质的高机械强度15.何谓整体修饰？利用不同官能度的卤代硅烷或烷氧基硅烷的水解、缩聚反应，以直接制出成空间交联型、含不同R基的硅胶16.几类硅烷化试剂各有何特点？氯硅烷：和空气中的水反应，放出具有腐蚀性和刺激性的HCL气，易对环境造成污染和危害烷氧基硅烷：对环境和人体危害小很多，用于离子交换、疏水作用、凝胶过滤以及亲和作用等色谱填料制备中烷基硅胺烷：高活性17.何谓正相色谱、反相色谱？正相色谱法：亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，极性柱也称正相柱。