项目二 SOD的生产 操作过程

超氧化物酶（SOD）的生产SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。

对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。

1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。

它催化如下的反应：202+2H+→H2O2+O2O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。

它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。

SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。

尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。

这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。

一、实验目的a．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。

b．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。

二、实验原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。

同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。

得到较纯的酵母菌菌体
返回
酵母培养基配方
葡萄糖8% 蛋白胨1% 酵母膏1% 蒸馏水 1000ml
121℃灭菌20min
按30％接种量接入 经过洗涤后的酵母
恒温摇床培养 28℃140r/min 2h
扩大培养， 得到含SOD的湿菌体
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每1 g酵母湿细胞 中加入9 mL异丙醇
浸泡120 min 抽滤除去溶剂
SOD粗提液
搅拌120min 离心除去菌体
加入三倍体积的50mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.0）
返回
每1 g酵母湿细胞 中加入9 mL异丙醇
浸泡120 min 抽滤除去溶剂
SOD粗提液
搅拌120min 离心除去菌体
加入三倍体积的50mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.0）
返回
SOD的等电点在pH4.0左右， 而杂蛋白在pH5．0时沉淀量很 多，因此提取时将pH调节到5
啤酒废酵母提取sod的意义酵母泥洗涤酵母培养基灭菌酵母菌复壮sod纯化sod提取sod实验过程实验过程啤酒废酵母菌等量无菌冰水80100目筛离心分离离心分离沉淀注入无菌冰水摇匀静置34h倾去上层悬浊液冰水漂洗冰水漂洗直到所得上层清液无色无味直到所得上层清液无色无味酵母呈纯白色为止酵母呈纯白色为止得到较纯的酵母菌菌体得到较纯的酵母菌菌体返回葡萄糖8蛋白胨1酵母膏1蒸馏水1000ml酵母培养基配方酵母培养基配方121121灭菌灭菌20min20min按30接种量接入经过洗涤后的酵母恒温摇床培养28140rmin2h扩大培养得到含sod的湿菌体返回搅拌120min离心除去菌体sodsod粗提液g酵母湿细胞中加入9ml异丙醇加入三倍体积的50mmoll磷酸钾缓冲液ph70浸泡120min抽滤除去溶剂返回搅拌120min离心除去菌体sodsod粗提液g酵母湿细胞中加入9ml异丙醇加入三倍体积的50mmoll磷酸钾缓冲液ph70浸泡120min抽滤除去溶剂返回sod粗提液mollhcl调节ph至50加入丙酮搅拌摇匀离心5000rmin调ph到40加入丙酮二次沉淀离心5000rminsodsod纯化产品纯化产品sod的等电点在ph40左右而杂蛋白在ph50时沉淀量很多因此提取时将ph调节到5返回丙酮分级沉淀操作时宜在410条件下进行有利于提高蛋白沉淀效果保护酶活性

SOD的介绍
广泛存在
大量数据表明， 所有需氧细胞包括最简单的微生物体内都 含有SOD。迄今人们已分别从细菌、真菌, 原生动物, 藻类, 昆虫, 植物（如茶叶, 大豆, 小麦叶片和小白菜等）, 动物 （如肝脏、血液） 等生物材料中分离得到SOD 应用领域 可以用于抗衰老，抗肿瘤，可用于调节人体内分泌 可以用于治疗多种炎症
动物血液提取SOD
从动物血中分离提取SOD的工艺流程: 新鲜血液
血浆（用于凝血酶提取） 提取 离心液 萃取 血球
离心 离心 加热 丙酮
上清液
丙酮 分离
沉淀物
上清液
洗涤
沉淀物
植物组织SOD的提取
从植物组织中提取SOD的工艺流程：
植物组织
搅碎
浆液
浸提
浸提液
冷冻离心
上清液
一定量硫酸铵
50%饱和度溶液
冷冻离心
[5]蔡志华.木瓜超氧化物歧化酶提取工艺初探.安徽农业科学，2008（5）:1796， 1797.
[6]李祖明，霍笑靓，高丽萍，惠伯棣，杨卫东，王栋，白志辉.酶法辅助超声波法 提取类红细菌SOD工艺研究.沈阳大学学报，2014，2:47—51
冷冻离心
上清液
一定量硫酸铵
90%饱和度溶液
沉淀
微生物中提取SOD
从微生物中提取SOD的工艺流程：
培养细菌
破壁 溶解目的蛋白
离心收上清 透析
硫酸铵分级盐析 过柱
洗脱
讨论
动物血液里提取SOD的技术最成熟，提取的量大
植物细胞里采用硫酸铵分级沉淀提取法，避免了因有机溶 剂处理使SOD失活的缺点 微生物提取SOD采用了柱层析法，纯度较高
参考文献
[1]尤丽琴，于颖，徐桂花.羊血中SOD的提取工艺研究.中国食物与营 养,2003,3:46-48.

实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。

组织捣碎机处理10min。

↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。

加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。

↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。

↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。

↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。

↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。

4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。

部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。

qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。