南五味子液相色谱指纹图谱研究
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南五味子液相色谱指纹图谱研究
李学龙;杨博;徐鹏;付绍平;鱼红闪;金凤燮
【摘 要】利用反相高效液相色谱法建立了南五味子指纹图谱.采用Hypersil ODS2色谱柱(5 μm,200 mm×4.6 mm),甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长235
nm,体积流量1.0 mL/min,柱温35℃.建立了由41个指纹峰和19个共有峰组成的液相色谱指纹图谱,并对不同产地的南五味子药材进行了相似度比较.结果表明,方法准确可靠,重现性好,可用于不同产地南五昧子药材的指纹图谱建立和质量评价,为有效控制南五味子药材的内在质量提供依据.
【期刊名称】《大连工业大学学报》
【年(卷),期】2009(028)001
【总页数】5页(P4-8)
【关键词】南五味子;指纹图谱;质量控制
【作 者】李学龙;杨博;徐鹏;付绍平;鱼红闪;金凤燮
【作者单位】大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学,辽宁省发酵工程重点实验室,辽宁,大连,116034
【正文语种】中 文
【中图分类】R284.1;TS972.123.7
0 引 言
中药南五味子(Fructus schisandrae sphenantherae)是木兰科植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils. 的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效[1]，天然分布于我国华中、华南和西南地区[2]。五味子植物中含有的二苯环辛二烯 (dibenzo-[a,c]-cyclooctadiene)结构木脂素是其主要生理活性成分，具有抗自由基氧化、抑制肝损伤和抗肿瘤作用[3-5]。目前，中国药典规定的对南五味子的质量以五味子酯甲为考察指标(规定质量分数不小于0.12%)，这种对单一成分的检测难以说明药材的内在品质。
目前，色谱指纹图谱已成为国内外广泛接受的中药质量评价模式[6-8]。范卓文等人[9]建立五味子不同提取方法指纹图谱，对不同提取方法得到的五味子样品进行了色谱分析，并简单比较各峰的相对峰面积和相对保留时间；蔡宝昌等人[10]和陈洪轩等人[11]都只是对同一产地五味子10批次样品进行了色谱分析，把建立了共有模式谱图称为指纹图谱。南五味子和北五味子属于同科不同属的植物，它们的化学成分存在较大的差别，中国药典把它们分列成两种不同的药材，其鉴别指标也完全不相同。本文在对北五味子液相色谱指纹图谱进行研究的基础上[12]，按照国家食品药品监督管理局对于指纹图谱创建的最新要求，通过收集多个主产地南五味子药材样品进行色谱分析，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”，最终建立了由41个指纹峰和19个共有峰组成的有广泛代表性的南五味子指纹图谱。通过对照谱图的相似度计算，可以很好地区别不同产地南五味子质量优劣，为进一步研究南五味子的药理活性和科学评价其质量提供了有效的方法。
1 实 验
1.1 仪器与试剂
美国Waters 2695-2996 PAD高效液相色谱仪及Empower色谱工作站。甲醇为色谱纯(美国Merck公司)，水为娃哈哈纯净水(过0.45 μm滤膜)，其他化学试剂均为分析纯。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素购自中国药品生物制品检定所，五味子醇乙购自南京崇原生物科技有限公司。
11个南五味子样品来源于不同产地(S1：河北I，S2：河北II，S3：福建，S4：湖北，S5：浙江，S6：山西，S7：河南，S8：四川，S9：甘肃，S10：陕西，S11新疆)，由大连工业大学张宗申教授鉴定为木兰科植物五味子的干燥果实。
1.2 色谱条件
Hypersil ODS2色谱柱(5 μm， 200 mm×4.6 mm，大连依利特分析仪器有限公司)；流动相：甲醇(A)-水(B)，0～5 min，50%A等度；5～45 min，50%A～80%A线性梯度；45～50 min，80%A～95%A线性梯度；进样量，10 μL；柱温，35 ℃；体积流速，1.00 mL/min；检测波长，235 nm。
1.3 样品溶液的制备
将南五味子药材用粉碎机粉碎后过30目筛，于60 ℃下干燥6 h。称取干燥的五味子粉末2.0 g，加入50 mL乙醇后加热回流2 h，经布氏漏斗过滤得到滤液，称重并补足乙醇损失重量。乙醇提取液经0.45 μm滤膜过滤，即作为五味子HPLC分析用的供试品溶液。
2 结果与讨论
2.1 方法学考察
2.1.1 重现性实验
按照“1.3”节中的方法制备供试品溶液, 取S5-浙江五味子样品5份，按照“1.2”节所述条件进行液相色谱分析。色谱图中各主要色谱峰的保留时间和峰面积的RSD分别为0.53%～2.60%和1.50%～3.20%，表明本方法的重现性良好。
2.1.2 稳定性实验
取同上药材样品制备供试品溶液,分别在样品制备完成后第0，4，8，16，24，48 h进行液相色谱分析，色谱图中各主要色谱峰的保留时间和峰面积的RSD分别为1.53%～3.20%和2.50%～4.60%,表明供试品在48 h内稳定。
2.2 南五味子指纹图谱的建立
在优化的色谱条件下，对11个南五味子药材样品进行了分析，其典型的液相色谱图见图1，在色谱图中选择归一化峰面积大于0.5%的色谱峰作为指纹峰。最终选择了19个共有的指纹峰(占总的峰面积的87%以上)，并且通过对照标准品的保留时间和紫外光谱，确定了3个主要的木脂素指纹峰。图2是木脂素对照品色谱图，其中a、b、c、d和e峰分别是五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。
图1 南五味子(浙江)药材乙醇提取物色谱图Fig.1 Chromatogram of the
ethanolic extract of Fructus schisandrae sphenantherae of S5 sample
图2 5个木脂素单体标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of five lignan
standards
本文采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”，将11个南五味子的色谱图导入软件后，剪切掉前5 min的溶剂峰，通过色谱峰多点校正的方法，对11个样品的色谱峰进行匹配并自动生成对照指纹图谱(R)。表1是11个南五味子色谱峰匹配结果；图3是样品匹配前的色谱图；图4是样品匹配后的色谱图，其中包括木脂素标准品谱图和自动生成的南五味子对照指纹图谱，该指纹图谱是由41个指纹峰和19个共有峰组成。
表1 南五味子乙醇提取物色谱峰匹配结果Tab.1 Matching result of
chromatographic peaks of the ethanolic extract of eleven schisandrae
sphenantherae
samplesNo.t/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11R110.486163.114 0101.266
0128.519 0135.526 053.460 00141.923 052.121 00101.520 0175.611 0145.284 0105.964 0118.573 0215.354215.762 0198.215 0202.694 0169.142
082.018 00235.438 0107.508 0162.107 0291.329 0125.078 0117.990
0173.389 0315.825000063.361 00076.708 0091.6550 0137.055 00033.525
00416.3630000140.997 00115.084 0238.958 094.499 000053.594
00518.942000000043.662 0 044.680 00008.031 000619.58911.873
0031.666 00021.059 0021.767 0026.029 008.773 00030.366 0038.512
0023.098 0018.772 0021.083 00720.52273.681 0053.012 0053.772 0069.385
0057.262 0064.004 0044.177 0064.205 0091.645 0080.601 0051.151
0063.900 00822.126000071.806 00058.964 0097.428 0032.757 000023.723
00922.9880062.828 00070.463 0076.300 0071.643 00000025.567
001023.35414.617 0017.081 0049.668 0017.298 0060.629 0064.729
0043.252 0074.359 0039.350 0021.102 0025.700 0038.890
001124.01679.237 0054.030 0047.582 00101.375 056.626 00114.777
037.668 00108.983 0145.499 0103.772 071.957 0083.773
001224.61400117.153 072.826 00156.671 0182.316 0157.676 0000062.422
001325.49847.931 0057.690 0074.895 00131.726 0208.220 0118.652
0106.526 090.295 0050.559 00108.222 072.595 0097.028 001426.03875.245
00000196.537 0118.613 049.728 00127.358 0299.446 00078.812
001526.520000031.901 00025.859 0000005.251 0001627.02833.293
0040.293 0094.995 00069.375 00000069.346 00117.468 038.615
001727.4440000136.355 0142.264 038.826 00137.289 0201.945 00059.698
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