绞股蓝总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
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中国实验诊断学２０１３年１Ｏ月 第１７卷第１Ｏ期
文章编号：１００７—４２８７（２０１３）１０—１７７５—０４
绞股蓝总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
居立娟 ，王云东
（１．吉林市儿童医院儿内科，吉林吉林１３２００１；２．北华大学第二临床医院・吉化总医院眼科）
摘要：目的 探讨绞股蓝总皂苷（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅｓ，ＧＰ）对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 采用 线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，实验分为假手术组、模型组、血塞通阳性药组（２Ｏ ｍｇ・ｋｇ ）、绞股蓝总皂苷 高、中、低剂量组（１００、３０和１０ ｍｇ・ｋｇ＿１），观察绞股蓝总皂苷对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分、脑组织匀浆中 ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＮＯ含量等生化指标及梗死面积变化的影响，同时观察ＨＥ病理改变，用免疫组化方法观察绞股蓝总皂苷 对Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ蛋白表达的影响。结果与模型组比较绞股蓝总皂苷可改善大鼠神经功能评分（Ｐ＜Ｏ．０５），提高大鼠脑 组织中ＳＯＤ活性（Ｐ＜０．０５），降低其ＭＤＡ含量（Ｐ＜Ｏ．０５），缩小脑梗死面积（Ｐ＜０．０５）。免疫组化结果显示绞股蓝 总皂苷可明显提高Ｂｃｌ一２呈阳性的细胞数（Ｐ＜ｏ．０５），降低Ｂａｘ阳性的细胞数（Ｐ＜ｏ．０５）。结论 绞股蓝总皂苷能够 改善大鼠脑缺血再灌注损伤，可通过保护脑组织抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化反应，减轻自由基对脑组织的损 害，对缺血再灌注脑组织具有治疗作用。 关键词：皂苷；缺血／再灌注；自由基 中图分类号：Ｒ７４３ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅｓ ｏｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ ＪＵ Ｌｉ—ｊｕａｎ，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ—ｄｏｎｇ． （Ｃｈｉｌｄｒｅｆｆｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ，Ｊｉｌｉｎ １３２００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅｓ（ＧＰ）ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｊ ｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｓｅｔ ｕｐ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄ— ｅｌ ｉｎ ｒａｔｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ．Ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｉｘ ｇｒｏｕｐｓ：ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ， Ｓｈｕｘｕｅｎｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＧＰ～ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ（１００、３０和１０ ｍｇ・ｋｇ ）．Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔ ｓｃｏｒｅ，ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＳＯＤ，ＭＤＡ，Ｎ０，ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｒｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ＨＥ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ０ ｃａ１ ｃｈａｎｇｅ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ Ｂａｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ＧＰ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔ ｓｃｏｒｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧＰ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ ｒｅ— ｄｕｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＧＰ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔＯ ｉｔｓ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ，ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｒａｄｉ— ｃａｌ ｆｒｏｍ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅｓ；ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ；ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ （ＣｈｉｎＪ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，２Ｏ１３，１７：１７７５）
绞股蓝别名七叶胆、小芍药云、罗锅底、遍地生 根等。其味苦、性寒，具有清热解毒、祛痰止咳之功 效。绞股蓝的主要成分为绞股蓝总皂苷（Ｇｙｐｅｎｏ—
ｓｉｄｅｓ，ＧＰ）。近年来，人们对ＧＰ进行了大量研究， 发现其有广泛的药理作用，其中对心脑血管的研究 引起了学者的广泛关注。研究发现，ＧＰ能够保护
心脏的缺氧性损伤，改善心肌缺血时心脏的舒张功 能ｌ１］，在一定程度上还能减轻甚至阻止心肌缺血所
致心肌坏死，减少自由基的生成和钙离子内流＿２。］。
ＧＰ能够舒张血管，降低血压，抑制血小板聚集，对 氧自由基引起的脑血管痉挛具保护作用［４ ］。虽然
绞股蓝总皂苷对脑缺血损伤具有一定的保护作用， 但是其作用机制方面的研究资料报道较少。
本文通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，研 究绞股蓝总皂苷对脑缺氧性损伤的保护作用并探讨
其机制，为脑缺血的预防提供新的思路，同时也为开 发抗脑缺血新药提供有价值的理论依据。 １材料与方法
１．１试剂与动物 绞股蓝总皂苷购于西安鸿生生物技术有限公
司；Ｈｚ Ｏｚ购于北京鼎国生物技术发展中心；ＳＯＤ、 ＭＤＡ检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；
Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ大鼠多克隆抗体购于美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｎｚ公
司；ＤＡＢ检测试剂盒购于福州迈新生物技术开发公 司。 １．２动物分组及给药
６Ｏ只雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重２００—２５０ ｇ，按体重 随机分为６组，每组１Ｏ只，即假手术组、模型组、血
塞通阳性药组（２０ ｍｇ・ｋｇ ）、绞股蓝总皂苷高、 中、低剂量组（１００、３０和１０ ｍｇ・ｋｇ ）。每天腹腔 注射（ｉｐ）给药１次（前两组为相同体积的生理盐
水），连续给药７天。 １．３大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立 末次给药３０ ｍｉｎ后，模型组、阳性药组及受试
药各剂量组用２Ｏ 水合氯醛麻醉，分离右侧颈总动 脉和颈内、颈外动脉，颈总动脉剪口后将一段一端加
热变钝的３．５号鱼线插入颈内动脉并推入至前脑动 脉约１８ ｍｍ（自颈内外动脉分叉处算起），用缝合线
结扎固定尼龙线，缝合皮肤。术后２ ｈ出现竖毛，右 眼ｈｏｒｎｅｒ＇ｓ征，左侧偏瘫的大鼠为阳性，２ ｈ后进行 缺血再灌注。假手术组只对颈内和颈外动脉进行分
离，不结扎。 １．４大鼠神经功能评分的测定
大鼠脑缺血再灌注２２ｈ后进行行为神经功能评 分，标准为：活动正常者为０分；竖毛，轻度运动低下
者为０．５分；前肢屈曲运动障碍者为１．０分；行动不
协调，屈曲姿势，转圈运动者为２．０分；偏瘫，不能行 走者为３．０分；昏迷者为４．０分；死亡者为５．０分 （术后２ ｈ以上死亡者）；运动障碍越明显者得分越
高。 １．５脑组织匀浆中ＳＯＤ、ＭＤＡ及ＮＯ含量测定
实验结束后，将大鼠立即断头取脑取血。取大 约０．１ｇ的脑组织制成均浆。ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＮＯ的检
测按照试剂盒说明书操作，分别在５５０ ｎｍ、５３２ ｎｍ 和３４０ ｎｍ处，用６０１０紫外分光光度计检测。
１．６脑梗死范围的测定 实验结束后，将大鼠立即断头取脑，将脑组织进
行冠状切片，间隔４ ｍｍ共５片，放入２ ＴＴＣ磷酸 盐缓冲液（ｐＨ７．４）３７℃水浴１０ ｍｉｎ，缺血缺氧坏死 的神经细胞因细胞膜损伤而导致脱氢酶缺失所以不 染色，呈现白色，而非坏死的神经细胞呈现鲜红色。
脑组织拍片后，应用ＢＩ２０００软件计算，以白色区面
积之和与脑组织总面积的百分比来计算脑梗死范
围。 １．７ ＨＥ染色 实验结束后，将大鼠立即断头取脑，脑组织常规 固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，
ＨＥ染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０ｌ３，Ｖｏｌ １７，Ｎｏ．１０
片，于光学显微镜（２００×）下观察，选取大脑中动脉 供血区不重叠的３个视野摄片。
１．８免疫组化染色检测Ｂｃｉ－２、Ｂａｘ蛋白的表达 脑组织切片脱蜡和水化后，置于湿盒内，滴加
５Ｏ １过氧化物酶阻断液（试剂Ａ），室温孵育１０ ｍｉｎ，阻断内源性过氧化物酶的活性，ＰＢＳ冲洗３
ｍｉｎ×２，滴加５０ ｌ非免疫动物血清（试剂Ｂ）室温孵 育１０ ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３ ｍｉｎ×２，去除血清，滴加５ｏ
ｌ一抗（兔抗大鼠Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ多克隆抗体，１：１００稀 释）４。Ｃ过夜，ＰＢＳ冲洗３ ｒａｉｎ×３，滴加５Ｏ ｌ辣根过
氧化物酶标记的二抗（羊抗兔多克隆抗体，试剂Ｃ） 室温孵育１０ ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３ ｍｉｎ×２，滴加５０ ｌ
ＤＡＢ，显微镜下观察３—１０ ｍｉｎ，自来水冲洗，苏木素 复染，氨水返蓝，梯度乙醇脱水。二甲苯透明，中性树
胶封片。光镜下观察细胞浆中有棕黄色颗粒者为阳 性细胞，每个标本在高倍镜下（４ＯＯ×）观察不重叠的 ２个视野，采用ＨＰＩＡＳ一１０００型图像分析仪计数阳
性细胞数，取平均值。 １．９结果处理和统计
所有数据均以平均值±标准差（Ｘ±ＳＤ）表示， 应用ＳＰＳＳ１１．５版统计学软件进行处理。各组间比
较采用单因素方差分析，成组数据比较采用ｔ检验， 百分数的比较采用Ｙ 检验，以Ｐ＜０．０５为具有统
计学意义。 ２ 实验结果 ２．１绞股蓝总皂苷对大鼠神经功能评分的影响
结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功
能评分明显升高（Ｐ＜０．０１），说明模型成立；与模型 组比较，绞股蓝总皂苷１００ ｍｇ・ｋｇ、３０ ｍｇ・ｋｇ 剂量组大鼠神经功能评分明显降低（Ｐ％０．０５）与阳
性对照药血塞通组作用相近；而绞股蓝总皂苷１０ ｍｇ・ｋｇ 剂量组大鼠神经功能评分与模型组比较
差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。结果见表１。
表１ 绞股蓝总皂苷对大鼠神经功能评分的影响
与模型组比较 Ｐ＜Ｏ．０１，
Ｐ＜０．０５；与假手术组比较＋＋Ｐ
