结晶紫饱和甲醇溶液

常用染色液的配制1．草酸铵结晶紫染色液A液：结晶紫2.5g，95%乙醇25mL。

B液：草酸铵1.0g，蒸馏水1000mL。

制备时，将结晶紫研细，加入95%乙醇溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合静止48h后，过滤后使用。

2．鲁格尔氏（路戈氏）碘液碘1.0g，KI 2.0g，蒸馏水300mL。

先用3~5 mL蒸馏水溶解KI，再加入碘片，稍加热溶解，加足水过滤后使用。

3．脱色液：95%乙醇；或丙酮乙醇溶液：95％乙醇70mL，丙酮30mL4．沙黄（番红）染色液2.5％沙黄（番红）乙醇溶液：沙黄（番红）2.5g，95%乙醇100mL。

此母液存放于不透气的棕色瓶中，使用时取20mL母液加80mL蒸馏水使用。

5．0.1％美兰染色液0.1g溶解于100mL蒸馏水中。

6．吕氏碱性美蓝色染色液A液：美蓝0.3g，95%乙醇30mL。

B液：KOH 0.01g，蒸馏水100mL，分别配制A液和B液，混合即可。

7．瑞氏染色液瑞氏染料粉未0.3g,甘油3mL，甲醇97mL。

将染料放乳钵内研磨，先加甘油，后加甲醇，过夜后过滤即可。

8．5％孔雀绿水溶液（芽孢染色用）孔雀绿5.0g,蒸馏水100mL。

先将孔雀绿放乳钵内研磨，加少许95％乙醇溶解，再加蒸馏水。

9．黑色素水溶液（荚膜负染色用）黑色素10g，蒸馏水100mL，40％甲醛（福尔马林）0.5mL。

将黑色素溶于蒸馏水中，煮沸5min，再加福尔马林作防腐剂，用玻璃棉过滤。

10．硝酸银鞭毛染色液A液：单宁酸5.0g，FeCL3 1.5g，福尔马林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸馏水100mL。

B液：AgNO3 2.0g,蒸馏水100mL。

将AgNO3溶解后，取出10mL备用，向其它的90mL硝酸银液中加浓氢氧化铵，则形成很厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为之。

再将备用的硝酸银慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为之。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

结晶紫的配制和相关信息分子式为：C25H30ClN3变色范围pH6.0～7.0～9.0(黄→紫→紫红)。

...取间甲酚紫0.1g,加0.01mol/L氢氧化钠溶液10ml使溶解,再加水稀释至100ml,即得。

...取结晶紫0.5g,加冰醋酸100ml使溶解,即得。

...结晶紫的变色范围较复杂，颜色变化有紫、蓝、蓝绿、黄绿、黄，突跃点附近指示剂的颜色变化不明显，而显著的变色点明显早于滴定终点。

色范围pH6.0～7.0～9.0(黄→紫→紫红)。

...取间甲酚紫0.1g,加0.01mol/L氢氧化钠溶液10ml 使溶解,再加水稀释至100ml,即得。

...取结晶紫0.5g,加冰醋酸100ml使溶解,即得。

...结晶紫就是甲基紫，龙胆紫（1）0.13-0.5 黄色→绿色（2）1.0-1.5 绿色→蓝色(3) 2.0-3.0 蓝色→紫色好像是这样的: 结晶紫染色液：结晶紫 1 g95％乙醇20 mL1％草酸铵水溶液80 mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

结晶紫染液、番红染液如何配制？这个是革兰氏染色液的两种主要试剂，常规配法如下，如果用量少可以订购现成的，用量大自己配合算。

(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。

(4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

PH试剂有甲基红、溴甲酚绿、百里酚蓝这三种指示剂酸碱指示剂用于酸碱滴定的指示剂，称为酸碱指示剂。

（acid-base indicator)。

这是一类结构较复杂的有机弱酸或有机弱碱，它们在溶液中能部分电离成指示剂的离子和氢离子（或氢氧根离子），并且由于结构上的变化，它们的分子和离子具有不同的颜色，因而在pH不同的溶液中呈现不同的颜色。

常用染色液的配制１．染料饱和酒精溶液的配制配制染色液常先将染料配成可长期保存的饱和酒精溶液，用时再予以稀释配制。

配制饱和酒精溶液，应先用少量95％酒精先在研钵中徐徐研磨，使染料充分溶解，再按其溶解度加于95％酒精之中，贮存于棕色瓶中即可。

附表1 几种常用染料在95%酒精中的溶解度(26℃)染料名称美蓝结晶紫龙胆紫碱性复红沙黄溶100mL95％酒精中的重量(g) 1.4813.8710.003.203.412．常用染色液的配制（１）碱性美蓝(亦称骆氏美蓝)染色液：取美蓝饱和酒精溶液30ml，加入0.01％氢氧化钾水溶液l00mL，混合即成。

此染色液在密闭条件下可保存多年。

若将其在瓶中贮至半满，松塞棉塞，每日拔塞摇振数分钟，并不时加水补充失去的水分，约1年后可获得多色性，成为多色美蓝染色液。

（２）草酸铵结晶紫(亦称赫克结晶紫)染色液：取结晶紫饱和酒精溶液2mL，加蒸馏水18mL稀释10倍，再加入1％草酸铵水溶液80mL，混合过滤即成。

（３）革兰氏碘溶液：将碘化钾2g置乳钵中，加蒸馏水约5mL。

再加入碘片1g，予以研磨，并徐徐加水，至完全溶解后，注入瓶中，被加蒸馏水至全量为300mL即成。

此液可保存半年以上，当产生沉淀或褪色后即不能再用。

（４）沙黄水溶液：沙黄也称番红花红。

将沙黄饱和酒精溶液以蒸馏水稀释10倍即成。

此液保存期以不超过4个月为宜。

（５）石炭酸复红染色液：取3%复红酒精溶液10mL，加入5％石炭酸水溶液90mL混和过滤即成。

（６）稀释石炭酸复红染色液：将石炭酸复红染色液以蒸馏水稀释10倍即成。

（７）3％盐酸酒精(亦称含酸酒精)：加浓盐酸3mL于95%酒精97mL中即成。

（８）瑞士染色色液：取瑞氏染料0.1g置乳钵中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。

将溶液倾入有色中性玻瓶中，并数次以甲醇洗涤乳钵，亦倾入瓶内，最后使全量为60mL即可。

将此瓶置暗处过夜，次日滤过即成。

此染色液须置于暗处，其保存期约为数月。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾 2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red)2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

结晶紫法检测TNF的生物活性[2012-7-13]TNF包括TNFα与TNFß两型，它们具有极其相似的生物学活性，在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用，而对正常细胞则无细胞毒效应。

根据这一特点，可利用TNF对敏感靶细胞的细胞毒效应，在体外检测TNF的活性水平，既可检测分泌型TNF(sTNF)，也可检测膜结合型TNF(mTNF)。

最常用的方法是体外检测TNF对小鼠成纤维瘤细胞(L929细胞)的细胞毒效应。

【基本原理】TNF对L929细胞有细胞毒作用，如同时加用转录抑制剂放线菌素D，则可提高L929细胞对TNF的敏感性10～100倍。

利用染料结晶紫或MTT可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其OD值，即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率，通过计算细胞死亡率，并与sTNF标准品对照，即可检测待测样品sTNF活性单位。

【材料和试剂】(1)L929细胞株(存活率应>95%)(2)TNF标准品：作倍比稀释(100U/ml～0.1U/ml)。

(3)待测样品：作倍比稀释至少6个不同稀释度。

(4)0.25%胰蛋白酶(5)RPMI-1640培养液及PBS(6)0.25%结晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)(7)放线菌素D(分存液浓度为100ug/ml)(8)柠檬酸钠缓冲液(0.9%柠檬酸钠，0.02mol/L盐酸，47.5%乙醇，为脱色液);酸化异丙醇(0.04mol/LHCL 异丙醇)(9)96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)，刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱。

(10)酶标测定仪，570nm滤光片，630nm滤光片。

【操作步骤】(1)取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液;(2)用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml;(3)将上述细胞悬液加至96孔培养板，100ul/孔;(4)置37℃，5%CO2培养箱中培养24h;(5)吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照(即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液);(6)同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5～1μg/孔);(7)置37℃，5%CO2培养箱中培养12-14h;(8)甩弃上清，并用RPMI-1640培养液洗细胞1次;(9)每孔均加入0.25%结晶紫，100μl/孔，室温下染色10min;(10)甩弃上清，再用PBS洗板3次;(11)室温下凉干，加入柠檬酸钠缓冲液脱色，100μl/孔;(12)充分混匀后，用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm测各孔OD值。

实验室常用染色液和试剂配方【很全】实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

微生物染色液配制及染色法2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30mL0.01%氢氧化钾溶液100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。

2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。

滴加染液，染1～3min，水洗，待干，镜检。

2.1.3 结果菌体呈蓝色。

2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2.2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

2.2.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。

2.2.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。

水洗，待干，镜检。

2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。

革兰氏阴性菌呈红色。

注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。

2.3 耐酸性染色法(萎－倪二氏法)2.3.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。

2.3.2 3%盐酸－乙醇浓盐酸3mL95%乙醇97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。

2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。

染液如因蒸发减少时，应随时添加。

染5min，倾去染液，水洗。

2.3.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。