酶改造的方法

酶定向进化的原理和步骤

酶定向进化（enzyme directed evolution）是一种通过人为引导的、基于自然选择原则的酶改造方法，可以用于提高酶的活性、稳定性、底物范围等性质，以满足特定需要。其原理和步骤如下：

原理：

1. 酶定向进化是基于自然选择的原理。通过引入随机突变和筛选操作，筛选出具有所需性质的变体酶，再通过重复这一过程，逐步改进和优化酶的性能。

步骤：

1. 随机突变：通过诱发突变（例如随机突变、DNA Shuffling等）引入酶的突变，得到一组具有多样性的突变体酶库。

2. 筛选/选优：通过选择性试剂、高通量筛选系统等手段，筛选出表现出所需性质的突变体酶。这一步骤需要对酶的目标特性进行准确的定量、定性检测。

3. 特异突变体筛选：从筛选中得到的酶变体中，选出表现最佳的数个突变体。

4. 突变组合：根据选出的突变体酶，通过多种方式（例如DNA

Shuffling等）进行突变位点的组合，产生更多的突变体酶。

5. 筛选与优化：通过筛选和优化，选出具有更好性质的突变体酶。

6. 反馈循环：重复上述步骤，逐步优化酶的性质，直到满足所需。

总体来说，酶定向进化是通过不断引入突变和选择操作来改良酶的性能，然后通过逐步筛选和优化的方式，在突变体酶库中逐渐筛选出具有所需特性的酶。

酶分子的改造

酶应用存在的问题：

（1）不稳定、易变性：酶作用的最适PH条件一般在中性，PH值常偏离中性范围，使酶难

于发挥作用；

（2）具有抗原性：在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗

原性，直接注人会引起人体的过敏反应。

解决问题的方法：改变现有酶的特性：

（1）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构；

（2）通过生物工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。

一、酶分子的修饰。 1、概念：酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造

的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到

较高的经济效益。

2、酶分子修饰常见的方法。

◆部分水解酶蛋白的非活性主链。

◆利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰。

◆酶辅因子的置换。 3、酶进行化学修饰时的注意事项。

(1)修饰剂的要求：较大的分子质量，良好的生物相容性及水溶性，有较多的反应基团。

(2)酶性质的了解：酶的活性部位，侧链基团的化学性质，最适反应条件。

(3)反应条件的选择：在酶稳定的条件下进行。

二、酶的蛋白质工程。 1、概念：酶的蛋白质工程是指通过基因工程或随机诱变的方式改变编码酶蛋白分子的DNA

序列，从而达到改变酶的生理、生化特性的技术。 2、酶的蛋白质工程常用的方法。

（1）对于一些功能和特性仅仅有蛋白质一级结构中某些氨基酸残基的化学性质决定的酶，

可通过基因工程技术直接改变或消除这些侧链来改变原有酶的有关功能或特性；

（2）随机诱变编码酶蛋白的基因，然后进行定向的筛选和选择。

3、举例。

◆枯草杆菌蛋白酶：

功能：分解蛋白质，可用于去掉衣服上的血渍

缺点：在漂白剂的作用下失活（222位的甲硫氨酸易被氧化）。

改造：用丝氨酸或丙氨酸代替其222位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。

◆杂交酶：

杂交酶是指由来自两种或两种以上酶的不同片段构建成的新型的酶。利用高度同源的酶

摘要 酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径.

关键词 蛋白质工程 模拟 定向进化

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理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力.

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1 定向进化的原理

在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的.

参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法

一、 土壤蔗糖酶

3，5- 二硝基水杨酸比色法：

1、 试剂的配制

① 3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）

② pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

③ 8%蔗糖溶液。

④ 甲苯。

⑤ 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。

标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

2、操作步骤 称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

3、 结果计算 蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（毫克）=a×4

式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数