第３２卷第５期 ２００６年５月 ７４３～７４８页 作 物 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＯＮＯＭＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ Ｖ０１．３２．Ｎｏ．５ ＰＰ．７４３—７４８ Ｍａｙ，２００６
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ Ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
ＴＡＯ Ｊｕｎ 一．ＴＡＮ Ｒｕ—Ｆａｎｇ ａｎｄ ＬＩ Ｌｉｎｇ ’
（ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｏｎｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３１， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ； Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ａｌｍｏｓｔ ａｌｌ ｒｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（１／２ ＭＳ） ｃｏｎｔａｉｍｎｇ ２００ ｍｇ／Ｌ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｗｅｒｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ａｃｅｔｏｓｙｉｎｇｏｎｅ，ｓｉｌｖｅｒ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｃｏ—ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｐＨ ｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｆｏｒ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒ１２０５，１．０ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＯＤ６００），１５ ｍｉｎｕｔｅｓ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｃｏ－
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
一、目的要求
通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理
农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过
一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌
与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法
1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法
操作︰
（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。取
自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％
乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，
无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，
注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培
养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。 取
OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培
养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或
同时加入100～500μmol/的AS；
（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况
进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一
般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
实验九 植物遗传转化——农杆菌介导法
一、目的
了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术
二、原理
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关：
1. Ti 质粒 (tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)
T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和
LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GTTTACACCACAATATATCCTGCCA 3’
RB（＋链）5’TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC 3’
2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子
转化所必需的基因有virA、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链 5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下：
virA和virG组成型表达形成VirA和VirG蛋白 →VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活 →激活的VirG 诱导virC、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chvA、chvB（农杆菌运动、附着）、chvD、chvE（编码单糖结合蛋白、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌介导的水稻转化
实验目的
学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理
随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1. 取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
