革兰氏染色法步骤及注意事项

Masson三色染色液染色步骤及注意事项

号：G1340

规格：7×50ml/7×100ml

有效期：12个月有效

产品简介：

结缔组织狭义上是指其含有的三种纤维：胶原纤维、网状纤维、弹力纤维、而胶原纤维（collagenfiber）是分布最广、含量最多的一种纤维。Masson三色染色又称马松染色，是结缔组织染色中最经典的一种方法，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。所谓三色染色通常是指染胞核和能选择性的显示胶原纤维和肌纤维。该法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而，淡绿或苯胺蓝的分子量很大，因此Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈绿色或蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。

Masson试剂盒的特点：◆染色稳定；◆分化时间短，1-2秒；◆色彩清楚鲜艳；◆使用范围广，适宜于组织的石蜡切片、冰冻切片等染色；◆所染切片保存时间长且不易褪色。

产品组成：规格名称7×50ml7×100mlStorage

试剂(A):Weigert铁苏木素染色液A1:Weigert染液A25ml50mlRT避光A2:Weigert染液B25ml50mlRT

临用时，取A1、A2等量混合，成为Weigert铁苏木素染色液，不可预先配制后放置。试剂(B):酸性乙醇分化液50ml100mlRT试剂(C):Masson蓝化液50ml100mlRT试剂(D):丽春红品红染色液50ml100mlRT避光试剂(E):弱酸溶液50ml100mlRT试剂(F):磷钼酸溶液50ml100mlRT避光试剂(G):苯胺蓝染色液50ml100mlRT避光使用说明书1份

自备材料：

固定液：选用甲醛升汞或甲醛盐溶液、蒸馏水、系列乙醇、二甲苯、染缸

操作步骤（仅供参考）：

革兰氏染色实验注意事项

1.实验前准备：

-准备好所需的试剂和设备，包括水洗瓶、稀释盘、热源、革兰染色各液、镜片、显微镜等。

-检查试剂的保存期限，确保试剂的有效性。

-按要求进行无菌操作，保证实验环境的清洁。

2.样品处理：

-选择新鲜细菌培养物作为样品，确保细菌的新鲜度。

-为了避免脏染色，应在菌培养基上挑选单纯菌落。

-对于液体培养物，可以通过离心法将菌细胞沉淀下来，然后进行革兰氏染色。

3.实验步骤：

-充分清洗玻璃片，以免杂质对实验结果产生干扰。

-均匀涂取菌液于干燥的玻璃片上，切勿用手触摸菌液，以免污染样品。

-确保菌液均匀涂满玻璃片，避免过多或过少，以防染色效果不理想。

-染色时间要控制好，过长或过短都会导致结果错误，通常为30秒至1分钟不等。

-染色液要均匀地覆盖于菌液上，并避免气泡的产生。

-完成染色后，将玻璃片轻轻漂洗，去除多余染色液。 4.镜检操作：

-将染色后的玻璃片置于显微镜载物架上进行观察。

-根据细菌形态、染色性质以及结构特征进行初步鉴定。

-鉴定时要注意放大倍数的选择，以保证观察到细菌的细节。

-观察时要仔细观察细菌的形态、大小、排列方式等信息，并进行记录。

5.清洁工作：

-实验结束后，应及时清洗试管、显微镜载架、显微镜物镜等设备，防止细菌的交叉污染。

-废液和废弃物应按规定处理，避免对环境和人员健康造成危害。

6.安全操作：

-在进行实验时，应遵守实验室的安全操作规程，佩戴好个人防护用品，如实验服、手套和护目镜等。

-对于有毒性或刺激性的试剂，应注意避免直接接触。

-实验中注意火源和电源的使用安全，防止发生火灾或电击事故。

总之，进行革兰氏染色实验时，除了掌握正确的操作步骤外，还要注意实验前的准备和实验过程中的清洁工作，确保实验结果准确无误，并保证实验过程的安全进行。

革兰氏染色原理

革兰氏染色法包括以下几个步骤：

（1）制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

（2）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。

（3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，加入95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般为20-30s。

（5）复染：用番红液复染约2min，水洗。 [1]

（6）镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

革兰氏染色原理

细菌通过初染和媒染后，加入的结晶紫和碘液会在细胞内形成不溶于水的结晶紫—碘大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，导致其在用95%乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上细胞壁基本不含类脂，故乙醇处理后不能在其细胞壁上形成缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢的阻留在细胞壁内，使其呈现紫色。而革兰氏阴性细菌因其细胞壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上细胞壁类脂含量高，所以使用乙醇将类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大缝隙，结晶紫—碘复合物容易溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，导致其细胞又成无色。这时再用红色染料番红液进行复染时，革兰氏阴性细菌将获得一层新的颜色—红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。

革兰氏染色液操作步骤及注意事项－资料类

关键信息项

1、 染色液的组成成分

结晶紫染液

碘液

脱色液（乙醇或丙酮溶液）

复染液（沙黄染液或番红染液）

2、 操作所需的器材

载玻片

酒精灯

接种环

显微镜

染色缸

吸水纸

3、 样本的准备要求

细菌培养物的新鲜程度 培养物的浓度

涂片的厚度和均匀度

4、 染色的具体步骤

初染

媒染

脱色

复染

5、 操作过程中的注意事项

染液的使用量和作用时间

脱色程度的控制

避免染液干燥

样本的固定

6、 结果的观察与判断标准

革兰氏阳性菌的染色特征

革兰氏阴性菌的染色特征

不确定结果的处理方法

1、 引言 革兰氏染色法是细菌学中广泛应用的一种鉴别染色法，通过此方法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。为了确保革兰氏染色的准确性和可靠性，特制定本操作步骤及注意事项协议。

11 适用范围

本协议适用于使用革兰氏染色液对细菌进行染色的实验操作。

2、 染色液的组成成分

21 结晶紫染液

由结晶紫、乙醇和草酸铵溶液组成，用于初染，使细菌染上结晶紫的颜色。

22 碘液

由碘和碘化钾组成，用于媒染，增强结晶紫与细菌细胞的结合力。

23 脱色液

通常为乙醇或丙酮溶液，用于脱色，使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌呈现出不同的颜色反应。

24 复染液

常见的有沙黄染液或番红染液，用于复染，使革兰氏阴性菌染上复染液的颜色，增强对比。

3、 操作所需的器材

31 载玻片 要求洁净、无油脂和划痕，以便于细菌涂片的制作和观察。

32 酒精灯

用于加热固定细菌涂片，使其牢固地附着在载玻片上。

33 接种环

用于挑取细菌培养物，制作涂片。

34 显微镜

用于观察染色后的细菌形态和颜色，以判断其革兰氏染色结果。

35 染色缸

用于分别容纳不同的染色液，保证染色过程的有序进行。

36 吸水纸

用于在染色过程中吸干多余的染液，保持涂片的清洁。