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基因枪介导的转Ｖｐ－１基因小麦的获得及检测作者：杨晨，黄涛来源：《湖北农业科学》 2014年第2期杨晨ａ，ｂ，黄涛ａ，ｃ（华中农业大学，ａ．麦类作物分子生物技术实验室；ｂ．生命科学技术学院；ｃ．植物科学技术学院，武汉４３００７０）摘要：为了探究源于玉米的抗穗发芽基因Ｖｐ－１改良小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）抗穗发芽性状的可行性，以ｐｍｉ及ｂａｒ为筛选标记基因，通过基因枪介导法将Ｖｐ－１基因导入小麦栽培品种郑麦９０２３幼胚愈伤组织中，用甘露糖和双丙氨磷（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）２种不同的筛选剂筛选得到抗性植株并对其进行ＰＣＲ鉴定。
结果显示，通过ｐｍｉ／甘露糖筛选体系得到５３株抗性植株，其中５株为转基因小麦植株，转化率为０．２９％；通过ｂａｒ／Ｂｉａｌａｐｈｏｓ筛选体系得到１５２株抗性植株，其中１１株为转基因小麦植株，转化率为０．７８％。
关键词：小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）；基因枪转化；Ｖｐ－１基因；ｐｍｉ基因；ｂａｒ基因中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｑ７８１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）02－0265-03小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）穗发芽（Ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）是指小麦在收获前遇到阴雨或在潮湿环境下的穗上发芽现象，是一种世界性的自然灾害［１］。
Ｖｐ－１（Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ－１）是玉米体内控制穗发芽的重要调节基因，该基因编码种子特异性转录因子，通过影响植物脱落酸ＡＢＡ信号的传导促进与胚成熟相关基因Ｅｍ的表达，抑制α－淀粉酶活性，从而对种子休眠和发芽起着重要的调控作用［２］。
小麦中存在Ｖｐ－１基因的同源序列ＴａＶｐ－１，但ＴａＶｐ－１不能正确拼接，导致大部分成熟ｍＲＮＡ不能编码全长ＶＰ－１蛋白质，从而失去调节功能［３］。
将有功能的Ｖｐ－１基因导入到小麦中表达，可能会增强小麦的穗发芽抗性。
自１９９２年Ｖａｓｉｌ等［４］首次成功地将ｇｕｓ和ｂａｒ基因通过基因枪法导入胚性愈伤组织，获得第一株转基因小麦以来，小麦的遗传转化已取得较大的突破［５－７］。
直接利用PCR产物构建RNA干扰表达载体杨杰;仲维功;王才林;柳青;王明波;Narayana M.Upadhyaya【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2010(025)005【摘要】利用RNA干扰原理可以对作物进行遗传改良.构建RNA 干扰的发夹结构一般采用在引物两端加酶切位点方法,该方法涉及酶切位点多,步骤繁琐.本试验介绍一种直接利用PCR产物进行RNAi组成型表达载体构建的方法,该载体以潮霉素为筛选标记基因,适合水稻的遗传转化.【总页数】4页(P52-55)【作者】杨杰;仲维功;王才林;柳青;王明波;Narayana M.Upadhyaya【作者单位】江苏省农业科学院,粮食作物研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,粮食作物研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,粮食作物研究所,江苏,南京,210014;CSIRO Plant Industry,Canberra,Australian Capital Territories 2601,Australia;CSIRO Plant Industry,Canberra,Australian Capital Territories 2601,Australia;CSIRO Plant Industry,Canberra,Australian Capital Territories 2601,Australia【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 王静;魏蕾;邱堃2.人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价[J], 梅雯;孙美涛;自加吉;王唯斯;杨勇琴;余敏;熊伟3.一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用 [J], 赵思捷;李伯安;朱文琦;孙杰;侯俊;王友亮;李永利;李波;鲍春梅;张浩4.应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体 [J], 马建;厉志;刘艺苓;王丕武5.可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体 [J], 张超;刘刚;余少文;邢苗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小麦成熟期穗发芽作为一种品质性状和抗逆性状,一直倍受各国育种家的重视。
以往对抗穗发芽育种主要通过两条途径,一是以种皮色泽及一些生理指标为标记进行选择育种。
二是选择早熟品种,避开梅雨季节而防止穗发芽,这样得到的抗性品种,一方面抗性水平有限;另一方面早熟品种则因生育期缩短而影响产量水平。
近年来,许多研究表明α-淀粉酶活性的提高是造成穗发芽的直接原因[1],且控制α-淀粉酶活性的基因已被分离[2,3,4],为小麦抗穗发芽分子育种奠定了基础。
在已分离的抗穗发芽基因基础上,采用气动式基因枪,将抗穗发芽基因与抗除草剂基因导入栽培小麦品种中,通过优化轰击条件,利用优化的再生培养系统,获得再生植株,为解决当前生产中存在的穗发芽问题,提供可利用的种质资源。
1材料和方法1.1材料普通小麦豫麦34、豫麦18-64、温麦6号和济麦1号四个品种为转化起始材料;愈伤组织诱导培养(M S基本培养基+2mg/L 2,4-D+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),分化培养基(M S 基本培养基+1.0mg /LZ T+3-5mg /Lbialaphos+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),生根培养基(1/2M S 基本培养基+0.2mg /LNAA+1-2mg/L Lbialapho s +0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8);质粒pBluescript SK+:含种子发芽启动子Gli 及其下游的抗穗发芽基因(Phr-r )插入质粒的多克隆位点(M CS ),另一质粒,将CaM V35S 启动子及位于下游的bar 基因插入其多克隆位点作为筛选标记。
1.2方法剪取开花后12～14d 的幼穗,剥取幼嫩种子,用70%的酒精表面消毒1min ,无菌水冲洗3次,再用0.1%的升汞(Hgcl 2)消毒10min ,无菌水冲洗3～4次,在超净工作台解剖镊剥出幼胚,盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基上,放在直径9cm 培养皿中央2cm 的范围内,用Parafilm 进行封口,25℃暗培养待用。
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1775−1782 / ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01775小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析杨在东马信吴世文王宏伟孙鑫冀宪领李安飞孔令让*作物生物学国家重点实验室 / 山东农业大学农学院, 山东泰安271018摘要: AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因, 对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。
从赤霉菌诱导的小麦抗、感赤霉病近等基因系RNA差异表达谱中获得3个与AtNPR1类似的EST片段, 据此检索相应序列信息并设计引物, 从小麦中克隆得到3个cDNA全长序列, 分别命名为TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3, 其开放阅读框分别编码580、607和601个氨基酸残基。
序列分析表明, 这3个小麦NPR1-like蛋白都含有保守的BTB/POZ、ANK和NPR1_like_C结构域及功能氨基酸, 但仅TaNPR1具有2个对NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。
蛋白质聚类分析表明, TaNPR1与TaNPR2和TaNPR3的同源性均较低, 其中TaNPR1与NPR1蛋白聚为一类, 而TaNPR2和TaNPR3均与NPR1同源蛋白聚为一类。
实时荧光定量PCR分析结果显示, TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3基因都可被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。
与感病材料Apogee相比, 抗病近等基因系Apogee73S2中TaNPR1和TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达; 而TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应都较为缓慢且变化不明显。
这些结果表明, TaNPR1和TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。
关键词:小麦; NPR1-like基因; 赤霉病; 基因表达分析Cloning of NPR1-like Genes and Their Response to Fusarium graminearum In-fection in WheatYANG Zai-Dong, MA Xin, WU Shi-Wen, WANG Hong-Wei, SUN Xin, JI Xian-Ling, LI An-Fei, and KONG Ling-Rang*State Key Laboratory of Crop Biology / College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, ChinaAbstract:NPR1 gene plays a key role for systemic acquired resistance (SAR) and provides broad-spectrum resistance in Arabi-dopsis. Fusarium head blight (FHB), which is caused by Fusarium graminearum Schwabe, is a devastating disease of wheat worldwide. Based on the analysis of the gene expression profiling, we cloned three NPR1-like genes from wheat FHB near-isogenic lines induced by F. graminearum, and they were designated as TaNPR1, TaNPR2,and TaNPR3. The open reading frames of the three genes encoded 580, 607, and 601 amino acid residues, respectively. The three wheat NPR1-like proteins had conversed BTB/POZ, ANK, and NPR1_like_C domain as well as conversed amino acid residues with important functions. How-ever, only TaNPR1 had two conversed cysteine residues that are essential for the NPR1 oligomer formation. Phylogenetic analysis showed that TaNPR1 was involved in the NPR1 protein group, while TaNPR2 and TaNPR3 were close to NPR1 homologues. Quantitative RT-PCR assay revealed that the three NPR1-like genes could be induced by defense related signal molecules, such as salicylic acid and methyl jasmonate. TaNPR1 and TaNPR3 were induced earlier and up-regulated more significantly in response to F. graminearum infection in the resistant line Apogee73S2 than in the susceptible line Apogee. However, the transcription of TaNPR2 was not obviously changed in either the resistant or susceptible near-isogenic lines after inoculation with F. graminearum. These results suggest that TaNPR1 and TaNPR3 may be involved in the defense response to F. graminearum.Keywords:Triticum aestivum; NPR1-like genes; Fusarium head blight (FHB); Expression analysis为了抵抗病原菌的侵染, 植物在长久的进化过程中形成了一系列的防御机制, 其中系统获得抗性本研究由国家自然科学基金项目(31071405)和国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08009003)资助。
植物RNA干扰表达载体构建方法的研究
马建;魏益凡;厉志;王丕武
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2009(037)018
【摘要】从传统酶切-连接、同源重组、PCR技术为基础结合酶切-连接等方法,对近年来植物RNA干扰表达载体的最新构建方法进行综述.
【总页数】3页(P8364-8366)
【作者】马建;魏益凡;厉志;王丕武
【作者单位】吉林农业大学生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学生物技术中心,吉林长春,130118
【正文语种】中文
【中图分类】S188
【相关文献】
1.人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选 [J], 吴勇延;肖亮;单黎然;宋振;郭泽坤
2.人SUMO-2 shRNA干扰表达载体构建及其对细胞增殖的影响 [J], 李向云;黄宏;邢伟;郭韡;何静;孙志亚;徐祥
3.草莓果胶裂解酶RNA干扰表达载体构建 [J], 钱春;何桥;翟军鹏;宋波;夏蓓蓓;张兴国;梁国鲁
4.杨树微管功能研究植物表达载体构建及验证 [J], 罗莹; 张建国; 刘晓霞; 饶国栋;
陆海
5.人α-干扰素2b基因转化番茄、番木瓜的研究(Ⅰ)──—人α-干扰素2b基因植物表达载体构建方法的研究 [J], 周鹏;赵志英;郑学勤
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小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化高东尧;夏兰琴;马有志;徐兆师;徐惠君;杜丽璞;聂丽娜;李彦舫;原亚萍;李连城;陈明;孙金海【期刊名称】《植物遗传资源学报》【年(卷),期】2009(10)1【摘要】小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质。
Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系。
本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi。
采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株。
利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%。
本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据。
【总页数】7页(P9-15)【关键词】成熟期穗发芽;Vp-1基因;RNAi;遗传转化【作者】高东尧;夏兰琴;马有志;徐兆师;徐惠君;杜丽璞;聂丽娜;李彦舫;原亚萍;李连城;陈明;孙金海【作者单位】吉林大学农学部畜牧兽医学院;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室;吉林大学农学部植物科学学院;青岛农业大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】Q943.2;S512.1【相关文献】1.小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化 [J], 苏君艺;陆璇璇;朱维宁;张林生2.甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化 [J], 阳治国;谢甜;王浩杰;张露;欧阳钟鸣;王茂林3.甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化 [J], 张艺琼;刘洋;王茂林4.半胱氨酸蛋白酶基因RNA干扰表达载体的构建及油菜的遗传转化 [J], 安金玲;李晓晨;王景娜;周荣富;王茂林5.烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化 [J], 王卫锋;太帅帅;王鲁;刘贯山;李凤霞;高晓明;孙玉合因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因枪介导的转Yp-1基因小麦的获得及检测杨晨;黄涛【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(53)2【摘要】为了探究源于玉米的抗穗发芽基因Vp-1改良小麦(Triticum aestivum L.)抗穗发芽性状的可行性,以pmi及bar为筛选标记基因,通过基因枪介导法将Vp-1基因导入小麦栽培品种郑麦9023幼胚愈伤组织中,用甘露糖和双丙氨磷(Bialaphos)2种不同的筛选剂筛选得到抗性植株并对其进行PCR鉴定.结果显示,通过pmi/甘露糖筛选体系得到53株抗性植株,其中5株为转基因小麦植株,转化率为0.29％;通过bar/Bialaphos筛选体系得到152株抗性植株,其中11株为转基因小麦植株,转化率为0.78％.【总页数】4页(P265-267,271)【作者】杨晨;黄涛【作者单位】华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室,武汉430070;华中农业大学生命科学技术学院,武汉4300701;华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室,武汉430070;华中农业大学植物科学技术学院,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S512.1;Q781【相关文献】1.基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定 [J], 池青;周鹏;刘香利;程绘绘;赵惠贤2.基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定 [J], 周鹏;池青;吕金洋;刘香利;赵惠贤3.基因枪介导转hpa99基因小麦的获得和检测 [J], 柳金伟;焦娇;张洪滨;梁元存4.基因枪介导的转TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定 [J], 雷代丽;雷瑛彤;张琳;张阳璞;邓西平;杨淑慎5.基因枪法介导转人工合成Rs-AFP2基因小麦的获得和检测 [J], 廖勇;张增艳;徐惠君;杜丽璞;姚乌兰;辛志勇;任正隆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
普通小麦春化基因 VRN1 RNA 干扰载体构建及转基因小麦获得张宝娜;朱灿灿;张鹏钰;卫丽;王翔;姜玉梅;王同朝【摘要】为进一步探究春化基因 VRN1在小麦发育进程中的功能，利用荧光定量PCR 分析了 VRN1基因在不同发育特性小麦品种新春2号、京841中的表达情况。
结果表明，随着生育进程的推进，VRN1基因在新春2号叶片和茎尖中表达量均呈上升趋势，VRN1基因在京841叶片中呈波动上升趋势，在茎尖中表达量趋于0；以 pFGC5941载体为基础构建含有 VRN1反向重复序列的 RNA 干扰载体，利用农杆菌介导的茎尖转化法转化新春2号获得了再生植株，并通过PCR 法检测获得了转基因阳性植株，为从分子水平上实现小麦发育特性遗传改良和创育小麦新种质奠定了基础。
%In order to study the biological function of VRN1 in wheat developmental process,VRN1 expression patterns were analyzed using fluorescence quantitative RT-PCR in two vernalization characteristic varieties Xinchun No.2 and Jing 841.The results showed that the VRN1 transcription levels increased gradually in Xinchun No.2 leaves and shoot meristems.While the VRN1 transcription levels in Jing 841 leaves showed a wavelike rises,but the expression level in shoot meristems was very lowand nearly zero.The VRN1 RNA interference sequence was suc-cessfully introduced into vector pFGC5941,and the recombined vector was transferred into the shoot apical meristem of Xinchun No.2 by Agrobacterium-mediated transformation.Transgenic plants were detected by PCR amplification, which could lay a foundation for geneticimprovement of wheat developmental characteristics on molecular level and created new wheat germplasm for wheat breeding.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】6页(P57-62)【关键词】小麦;春化基因 VRN1;表达;转化【作者】张宝娜;朱灿灿;张鹏钰;卫丽;王翔;姜玉梅;王同朝【作者单位】河南农业大学农学院，河南郑州 450002;河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450002;河南农业大学农学院，河南郑州 450002;河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450002;河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450002;河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450002;河南农业大学农学院，河南郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】S512.03;Q78小麦春化作用是一个高度复杂的生理生化过程,也是小麦(Triticum aestivum L.)生长发育进程中的一个重要阶段,受多基因调控。
小麦春化作用主要受VRN1、VRN2、VRN3、VRN4等基因调控[1-3]。
普通小麦VRN1基因有3个同源基因,VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1[4-7]。
3个同源基因中任何一个基因的调控区发生插入、缺失,就能使VRN1基因变为显性,导致小麦发育特性表现为春性即不需要经过春化作用就能抽穗开花[8-9]。
前人研究表明,VRN1是小麦春化作用所必需的关键基因[1,10-11]。
VRN1基因编码一种MADS-box转录因子,其可与靶基因启动子区中的CArG-box特异结合,该转录因子是拟南芥分生组织鉴定基因AP1/FRUITFUL的同源基因;MADS-box转录因子是重要的温度响应基因,调控小麦由营养生长向生殖生长转变的发育进程[12-13]。
小麦中VRN1基因受低温诱导表达,随着春化时间的延长,VRN1的表达量逐渐增加,直到达到开花所需的量后,才能使植株由营养生长转向生殖生长[14]。
可见VRN1对春化作用的响应是具有一定阈值的。
袁秀云等[15]对国内不同春化发育特性小麦品种VRN1的基因组成进行分析发现,小麦品种的VRN1基因显隐性组成与该品种的春化发育特性基本符合,说明VRN1的显隐性组成是决定小麦发育特性的主要内在因素。
不同生态种植区小麦VRN1的3个等位基因分布比率及组合也不同,这一差异体现了植物适应性的多样性[16-18]。
为进一步探究春化基因VRN1在小麦发育进程中的功能,本试验以不同发育特性小麦品种新春2号和京841为材料,分析了VRN1的表达水平,并构建了VRN1 RNA干扰载体,利用农杆菌介导的小麦茎尖转化法进行遗传转化,以期深入探讨VRN1基因在小麦春化阶段的功能,为从分子水平上实现小麦春化特性遗传改良提供理论依据。
1.1 试验材料春性小麦品种为新春2号,冬性小麦品种为京841。
大肠杆菌菌株(Escherichia coli)为DH5α,克隆载体为pMD19-T,均购自TaKaRa生物公司。
农杆菌菌株为EHA105,植物表达载体为pFGC5941载体,均由国家小麦工程技术研究中心保存扩繁。
TRIzol等其他试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 小麦培养及取样分别选取新春2号和京841成熟饱满大小均一的种子,置于培养皿中,放置于温度为24 ℃的培养箱中。
萌动后种植到直径为30 cm的花盆中(花盆中的营养土∶草炭∶蛭石为3∶2∶1),放置在人工气候室中(温度为(22±2)℃,光周期为16 h光照/8 h黑暗)。
当2个小麦品种大部分幼苗都处于3叶期(在人工气候室生长3周)时开始取样,并观察幼穗分化进程。
每周取一次样,取倒数第二叶,春性品种取样直到小麦穗发育完成(羽毛形成期),冬性品种取样到试验结束为止。
每次取样时间均为光照开始后1～2 h,以尽可能避免基因节律表达对表达分析结果的影响。
所有样品用液氮速冻后,置于-80 ℃超低温冰箱保存用于RNA提取。
1.3 试验方法1.3.1 RNA的提取采用TRIzol试剂提取材料的总RNA。
1.3.2 荧光定量PCR(qRT-PCR)分析以各时期所取新春2号和京841的RNA反转录所得cDNA为模板,采用引物VRN1-F、VRN1-R及WAC-F、WAC-R(表1)对VRN1和β-Actin(内参基因)基因进行qRT-PCR扩增。
PCR反应系为20 μL,反应程序为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s。
反应在Bio-red CFX96 荧光定量PCR仪上运行,采用2-ΔΔCt方法进行定量分析,每个样品设置3个重复。
1.3.3 VRN1 RNA干扰表达载体的构建用引物对RiV1-F1/RiV1-R1和RiV1-F2/RiV1-R2(表2)扩增出VRN1的cDNA部分正、反向片段,连入pMD19-T载体后转化大肠杆菌DH5α,然后挑选白色菌斑于37 ℃摇菌,提取质粒。
先用NcoⅠ/SwaⅠ酶切带有正向片段的pMD19-T载体和pFGC5941载体,然后将酶切得到的正向目的片段与酶切后pFGC5941载体的大片段连接,再转化至大肠杆菌DH5α,挑取白色菌斑于37 ℃摇菌,提取质粒酶切检测,选取正确的阳性克隆进一步进行测序验证。
然后用BamHⅠ/SmaⅠ酶切带有反向片段的pMD19-T载体以及已插入正向目的片段的重组pFGC5941载体,并将切下的反向目的片段与已插入正向目的片段的重组pFGC5941载体酶切后的大片段连接,转化至大肠杆菌DH5α,挑取白色菌斑于37 ℃摇菌,提取质粒酶切检测,选取正确的阳性克隆进一步测序验证。
1.3.4 农杆菌介导的茎尖转化及转基因植株的获得选取饱满的新春2号种子进行灭菌,用70%的乙醇浸泡2 min,再用0.1% HgCl2浸泡5 min,无菌水冲洗3～5次。
灭菌种子摆放在培养皿中,加适量无菌水在黑暗条件下萌发。
同时将构建好的VRN1 RNA干扰表达载体转化农杆菌,挑取单克隆,将经PCR检测及重组质粒酶切验证为阳性的单克隆扩摇,当菌液OD600为1.0时即可用于侵染小麦幼苗茎尖。
待小麦幼苗长至2～4 cm时,用灭菌后的手术刀片沿胚根向胚芽鞘伸长方向向下切断维管束,然后水平方向切去胚芽及胚的上半部分,暴露或损伤生长点部位,将幼苗置于含有VRN1 RNA干扰表达载体的农杆菌菌液中浸泡几分钟。
用无菌滤纸吸干种子表面的菌液转入新的培养皿中,黑暗条件下共培养2 d后转入光照培养箱中,直至重新长出新叶,在人工气候室培养至成熟。
1.3.5 转基因后代的分子检测根据BAR基因设计一对特异引物BAR-F/BAR-R(表2)对转基因后代进行分子检测。
经过BAR基因检测为阳性的植株,为鉴定其是否含有插入目的基因,以T1植株DNA为模板,设计跨目的基因和载体序列的特异性引物VRN1-F3/VRN1-R3(表2),对T1转基因小麦植株进行PCR检测。
2.1 不同发育特性小麦品种中VRN1基因的表达水平从图1可以看出,从三叶期取样开始到取样第5周,新春2号叶片和茎尖中VRN1基因表达量均呈上升趋势;从取样开始到取样第3周,VRN1在茎尖中的表达量低于其在叶片中的表达量,但从取样第4周开始VRN1在茎尖中的表达量超过了叶片,在取样第5周达到最大值,此时新春2号穗发育完成(羽毛形成期)。
对于冬性小麦品种京841,叶片中VRN1的表达量总体呈波动上升趋势;在茎尖中的表达量很低,接近0,虽然取样第8，10周叶片中VRN1基因表达量升高,但依然达不到小麦开花所要求的阀值,其幼穗分化一直处于单棱期,说明在未春化条件下,京841不能正常进行穗分化。
2.2 VRN1 RNA干扰载体的构建用2对引物RiV1-F1/RiV1-R1和RiV1-F2/RiV1-R2分别扩增得到了VRN1 cDNA的部分正(V1-1)、反(V1-2)向片段,大小均为349 bp(图2-A)。
