RNA干扰载体的构建的实验流程图

shRNA实验步骤试剂image.png实验步骤1.合成Nestin干扰序列2.干扰序列退火将正反向干扰序列以10μM浓度溶于ddH2O，按以下体系将正反向干扰序列退火形成双链粘末端DNA：10 μL Forward oligo10 μL Reverse oligo5 μL 10x NEB buffer 225 μL ddH2O置于100度水，自然降温3.将Nestin干扰序列克隆至PLKO.1载体质粒3.1 PLKO.1载体质粒酶切AgeI HF+ EcoRI HF酶切pLKO.1载体质粒，体系如下：image.png37°C孵育1.5h。

(酶切时间可延长到＞2h)琼脂糖凝胶电泳，可见1kb和7kb两个条带，切胶回收7kb条带（靠凹槽的那条）。

Run digested DNA on 0.8% low melting point agarose gel until you can distinctly see 2 bands, one 7kb and one 1.9kb. Cut out the 7kb band and place in a sterile microcentrifuge tube.1、配制成1%琼脂糖胶（0.5小时）0.7g+70ml 1TAE溶液（浓度越大，区分度越小），加10000的核酸染剂（amino acid stain）7µl。

2、电泳槽中，黑色为负电极，红色为正电极，凹槽对着负极。

大凹槽可加50µl，小凹槽可加10µl。

3、吸取5µl DL5000 DNA marker加入电泳槽。

4、吸取5µl 10*DNA loading buffer加入PLKO酶切液中。

5、参数设定100V，20min左右（条带跑到胶中间比较合适）。

6、暴光200ms以上，观看条带。

When visualizing DNA fragments to be used for ligation, use only long-wavelength UV light. Short wavelength UV light will increase the chance of damaging the DNA.7、剪下条带，称重。

RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程，小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解，阻断相应基因表达。

我们为您提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段（SiRNA）和构建载体RNA （SnRNA）两种形式，客户只需提供干预基因名称或基因序列ID，我们免费设计合适的干预位点，保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达，抑制效率不低于70%。

RNA干扰流程步骤一确定干扰基因，设计并合成合适的小干扰RNA（片段型或载体型小干扰RNA）。

步骤二预转染实验，进行细胞培养，摸索转染条件、时间并进行必要的检测（WB，PCR 等），确定干预效果最佳的一对小RNA。

步骤三正式实验，设置合理实验分组，进行瞬时或稳定转染。

步骤四转染后检测，根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。

以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。

RNA干扰检测细胞检测细胞增殖毒性MTT 细胞凋亡细胞周期细胞迁移细胞侵袭蛋白检测免疫印迹WB 免疫细胞化学ICC 免疫荧光IF 流式细胞术FCM 酶联免疫ELISA分子生物检测RT-PCR 实时荧光定量PCR 甲基化特异性PCR(MSP)生化检测酶类检测脂类检测糖类检测1.材料报价片段型（SiRNA）1980元/套（含3组小RNA+阴性对照）载体型（SnRNA）2800元/套（含4组小RNA+阴性对照）；2.RNA干扰预实验报价片段型（SiRNA）2000元/每项目（含3组小RNA+阴性对照组+WB检测+定量RT-PCR检测）载体型（SnRNA）2500元/每项目（含4组小RNA+阴性对照组+ WB检测+定量RT-PCR检测）；3.RNA干扰正式试验报价细胞培养（普通培养）200元/瓶；细胞培养（转染培养）250元/瓶；细胞爬片50元/片注：每组WB检测需要1瓶细胞；PCR检测以及FCM检测需要1瓶细胞，细胞培养瓶子规格为T25（5×5cm）；4.RNA干扰下游检测报价参见各章节报价RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。

中文题目核盘菌SsMCM1转录因子互作蛋白RNA干扰载体的构建与鉴定英文题目Construction and identification of RNA interference vector of SsMCM1 transcription factor interacting protein in Sclerotinia sclerotiorum目录摘要 (1)Abstract (2)第一章前言 (3)1.1 核盘菌的生物学特性 (3)1.2 核盘菌病害的防治 (3)1.3 RNA干扰技术的历史背景 (4)1.4 RNAi的作用机制 (5)1.5 RNA干扰的诱导方法及载体构建 (6)1.6 RNAi在真菌基因功能研究中的优点和不足 (7)1.7 RNAi 技术在真菌中的应用前景展望 (8)第二章实验材料 (9)2.1 主要材料 (9)2.2 主要试剂 (9)2.3 主要仪器 (9)2.4 主要培养基 (9)第三章实验方法 (10)3.1 目的基因片段的选择和获取 (10)3.2 Ssste12基因RNA干扰载体的构建 (10)3.2.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (11)3.2.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (12)第四章Ssste12基因的RNA干扰载体的验证 (13)4.1 pSD-Ssste12干扰载体的验证 (13)4.2 pS1-Ssste12干扰载体的验证 (13)第五章结果 (15)5.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (15)5.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (16)结论 (17)致谢 (18)参考文献 (19)摘要核盘菌是一种对作物和蔬菜造成危害的世界性病原真菌,它的宿主范围遍布极其得广泛，能造成包含于至少75个科、278个属内的超过400种植物发生病理反应。

RNA干扰(RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA在mRNA水平上关闭特异性序列的基因表达或者使其沉默的过程，即RNA序列特异性转录后基因沉默。

病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1。

1慢病毒1。

1.1原理慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus—siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。

2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究.4）无需任何转染试剂，操作简便。

5) 可以根据客户需要制备多种标记。

1。

1。

3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3) 培养 48hrs — 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4) 病毒的纯化和浓缩。

5）分装、— 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告.1.2、腺病毒1。

2.1 原理腺病毒(Adenovirus,Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂.有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力.这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

如何进行动物体内RNA干扰实验动物体内RNA转染，轻松进行RNA干扰，基因敲除、沉默实验，3天可得出结果。

下面以50μg的核酸与25μl转染试剂，总注射体积200μl，20g小鼠尾静脉注射为例说明。

局部注射不用稀释，直接根据需要把核酸和转染试剂混合即可使用。

1. 核酸的稀释。

将50μg核酸用适量无内毒素纯水稀释成1μg/μl，加入10%葡萄糖溶液(w/v)50μl，使葡萄糖终浓度为5%，终体积为100μl，充分混匀。

2. 转染试剂的稀释。

取25μl的Entranster TM-in vivo试剂用50μl的10%葡萄糖溶液稀释，并用纯水25μl补足，得到葡萄糖终浓度为5%，终体积为100μl液体，充分混匀。

3. 转染复合物形成。

立即将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，立即充分振荡混匀。

4. 室温静置15分钟。

配制好的转染复合物请即配即用，不宜长期存放。

5. 动物注射。

说明：1).尾静脉注射时请掌握注射技巧，一般选用远端1/3处静脉注射，如感觉到阻力和轻微隆起，请停止注射，重新寻找静脉进行操作，不要强力推注，否则容易将药液注射在尾部，导致尾部溃烂。

注射完成后移去针头，按压针孔10秒以上，防止药液流出。

2). 2.5mg/kg的给药剂量是起始给药剂量，如果动物可以耐受，可以按比例增加剂量，这样效果更好。

3).局部注射，尽可能多注射药液，有利于提高转染效果。

6. 基因表达检测。

一般来说，根据注射方法和靶器官的差异，12-48小时后基因表达效果较好。

7. 长期给药。

一次给药检测的最佳时间是注射后12-48小时。

如果需要维持长期效果，可以采用多次注射的方法，注射频度一般为每间隔2-3天一次，也可以根据实验情况适当延长至每7天一次。

RNA干扰基本实验路线RNAi 是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。

不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：•对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；•适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；•适当的对照；•检测目标基因表达情况的方法1. 对应目标基因的dsRNA在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs结合到与之互补的mRNA 序列上，降解对应的mRNA，从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默，见下图（由权阳生物提供）：图片由权阳生物提供对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。

所以常见的做法是直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs 转入哺乳动物细胞(线路2，红色)；或者是将短发夹结构RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA(线路3，黄色)；最后siRNAs同样和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默。

线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi研究。

shRNA干扰载体构建SOP目录第一部分RNA干扰原理及shRNA设计2第二部分酶切与回收6第三部分退火与连接8第四部分转化与涂平板10第五部分挑菌与菌液PCR11第六部分质粒提取13第一部分RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1.目的：了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2.仪器与设备：需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。

3.操作步骤3.1RNA干扰原理1)RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。

当细胞中导入与源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。

由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

2)RNAi原理：RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。

在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。

证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

RNA干扰载体的构建的实验流程RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI 系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。

产品技术背景pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。

H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。

由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。

由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。

pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。

本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。

插入寡核苷酸设计pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。

合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。

正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。

连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。

1. 选择干扰序列在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。

我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。

RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。

RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。

不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。

一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。

磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。

磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。

该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。

【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。

（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。

【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。

2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。

3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。

4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。

5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。

6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。

【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。