海洋酵母菌发酵产铁载体的研究

分类号—————————————————————————————————密级UDC本科毕业论文海洋酵母菌发酵产铁载体的研究学生姓名毕海洋学号040012008003指导教师池振明教授院、系、中心海洋生命学院专业年级2008级生命基地班论文答辩日期2012年 6 月 8 日中国海洋大学海洋酵母菌发酵产铁载体的研究完成日期：2012年6月6日指导教师签字：答辩小组成员签字：海洋酵母菌发酵产铁载体的研究摘要铁载体在人类疾病的治疗、鱼病的控制及环境修复等方面有着巨大的应用前景。

本次实验使用已知的高产铁载体的海洋普鲁兰类酵母HN6.2及其改造菌株菌株。

将这两个菌株采用一系列不同的常用培养基进行培养，测量其在不同培养基中铁载体的产量。

然后选取铁载体产量最高的培养基在2L发酵罐中进行扩大化培养。

通过间隔连续取样，对菌株的生长情况、还原糖含量和铁载体产量进行检测，从而获得最佳的培养时间，从而为以后的实验提供参考。

最终得到的最佳培养基为加入了鸟苷酸的产铁载体培养基，最佳的培养时间为108h,铁载体产量可达0.511g/L.关键词：普鲁兰酵母、铁载体、培养基、扩大化培养、培养时间The studies on siderophore production by the marineyeastAbstractSiderophore has a great prospect for the treatment of human disease, fish disease control and environmental restoration. High-yield siderophore strain Aureobasidium pullulans HN6.2 and Its strain of gene knock-out are used in this experiment . These two strains are cultured with a range of different commonly used culture media. Measuring the production of siderophore in these media, then select the medium whose production of Siderophore is the highest for enlarge culture in a 2L fermenter. By sampling every 12 hours, the growth of the strains, reducing sugar content and siderophore production were detected,Then the best culture time can be got which can provide a reference for further experiments.Keywords: Aureobasidium pullulans HN6.2, siderophore, medium, enlarge culture, Incubation time目录1前言 (1)1.1铁载体的定义 (1)1.3真菌铁载体的生物合成 (3)1.4铁载体的检测 (5)1.4.1化学法 (5)1.4.2生物法 (6)1.5铁载体的应用 (7)2不同培养基中海洋普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2的铁载体产量 (7)2.1实验材料与试剂 (8)2.1.1菌种 (8)2.1.2试剂 (8)2.1.3培养基 (8)2.2培养条件 (8)2.2.1平板培养 (8)2.2.2液体培养 (9)2.3铁载体浓度测量（Csaky试验法） (9)2.4实验过程 (9)2.5实验结果与讨论 (9)3菌株的扩大化培养 (11)3.1 实验材料与试剂 (11)3.1.1 菌株 (11)3.1.2试剂 (11)3.1.3培养基 (12)3.2培养条件 (12)3.2.1平板培养 (12)3.2.2液体培养 (12)3.3铁载体浓度测量（Csaky试验法） (12)3.4蛋白浓度测量（考马斯亮蓝染色法） (13)3.4.1标准曲线的绘制 (13)3.4.2蛋白浓度测量 (14)3.5还原糖浓度测量（Somogyi-Nelson 比色法） (14)3.5.1标准曲线的绘制 (14)3.5.2还原糖浓度测量 (14)3.6 实验过程 (15)3.7实验结果与讨论 (15)参考文献 (18)致谢 (20)1前言几乎对于所有的生物来说，铁都是一种必需的元素。

作为一种过渡元素，铁可以再氧化与还原态之间进行可逆的转换。

因此在许多不同的辅助因子当中都含有铁元素，比如血红素基和铁硫簇。

这使得铁元素在包括脱氧核糖核酸合成，氧化磷酸化和电子运输在内的很多关键的代谢过程中都是不可或缺的。

同时，铁元素也可以促进有害生物分子氧化。

因此，通过控制铁元素的吸收和胞内储存，生物体体液内的铁元素浓度被牢牢的控制着。

铁在地壳中的丰度很高，居所有元素第四位。

因此自然界的铁元素含量相当丰富。

然而由于大气中的氧气使铁氧化为难溶于水的氧化物或氢氧化物，生物可利用的铁的量极其有限。

在可利用的铁元素极其缺乏的情况下，为了获取环境中的可溶性铁，大多数真菌都会合成至少一种类型的铁载体。

为了能够正常生存，大多数的真菌和细菌都拥有某些特殊的机制以从它们的宿主之中获得铁元素。

铁在许多生化反应中都有重要的催化作用。

然而由于宿主的封闭，真菌和细菌等微生物往往不能随意的从其所生存的环境周围获得铁元素。

高亲和力的铁元素吸收系统使得真菌能够从它们所寄宿动物或植物体内获取有限的铁元素，比如铁载体介导的铁元素吸收和还原性铁的同化。

要想保证细胞内正常的生化反应进行，同时又不会因为胞内铁元素过量而导致细胞中毒，就必须维持细胞内铁元素的稳态。

而调节铁的吸收又对维持细胞内铁元素的稳态起了至关重要的作用。

铁载体在真菌与宿主间的反应当中发挥着不同的作用。

铁载体的生物合成大多需要费核糖体肽合成酶的参与。

而非核糖体肽合成酶的基因敲除工作使得许多铁载体得以划定。

这些分析表明在许多真菌当中毒力、抗氧化胁迫、有性及无性发展、铁元素的储存和防止铁诱导性中毒等方面均有铁载体的参与。

1.1铁载体的定义铁载体是微生物适应低铁环境而合成的一类螯合铁离子的配位体（Winkelmann，1991），其分子量一般不大，约为500～1000Da。

绝大多数真菌和细菌都可以产生铁载体。

有一些微生物虽然不能产生铁载体，但却可以利用其他微生物合成的外源铁载体，如酿酒酵母（Lesuisse et al.，1998）。

铁载体最显著的特点就是对于三价铁离子超高亲和力，它甚至可以让微生物从不锈钢当中提取铁元素(Askwith et al. 1996; Neilands &Neilands 1995)。

Neilands（1981）将铁载体的特性归纳如下：（1）相对分子质量很小（500～1000Da），也有文献报道﹤1500Da；（2）它们对高铁离子具有高度特异性，高亲和力，结合常数在1025～1052之间，可以从宿主体内铁结合蛋白上摄取铁；（3）其生物合成受溶液中铁浓度的调节。

1.2铁载体的分类根据其化学组成，铁载体可以大体可以分为三种：1邻二苯酚类（catechols）2羧酸类（carboxylates）3异羟肟酸类（hydroxamates）。

除了由接合菌生产的羧酸类铁载体，几乎所有的真菌铁载体都是异羟肟酸类(van der Helm and Winkelmann 1994)。

大多数铁载体具有三个可以螯合铁的部位。

值得注意的是，有为数不少的真菌不仅可以摄取自身合成的铁载体，而且也同样可以摄取有其他真菌合成的不同类型的铁载体。

这种生存策略可能是为了与其他种类竞争或是为了保护自身能量代谢而进化出来的。

除了辅助摄取环境中的铁，铁载体在胞内铁的贮存当中也起着一定作用。

在很早以前就已经有人详细的发表过异羟肟酸类铁载体的化学性质(van der Helm and Winkelmann 1994; Renshaw et al. 2002)。

真菌的异羟肟酸类铁载体主要由四个家族组成：（1）玫瑰红酵母酸（rhodotorulic acid）（2）萎蔫酸（fusarinines）（3）粪生素（Coprogens）（4）高铁色素（ferrichromes）。

其代表性的结构及特点如图1-1所示：图1-1真菌异羟肟酸类铁载体结构Fig1-1 Structures of fugal hydroxamate siderophores 大多数铁载体包含三个羟基，这些羟基与肽键或酯键相连形成一个八面体复合体。

玫瑰红酵母酸的的结构最为简单，是Nδ-乙酰-Nδ-羟基鸟氨酸的哌嗪二酮。

重要的是，这种铁载体仅包含两个羟基基团，并形成铁2（玫瑰红酵母酸）3复合物。

萎蔫酸可以是单体、线性二聚体或三聚体，或环状三聚体。

萎蔫酸的前体，环状萎蔫酸C（也叫梭原素），包含有三个顺式N-乙酰-N-羟基鸟氨酸（被称为单体顺式萎蔫酸）。

它们之间以酯键相互连接。

萎蔫酸C的N-乙酰化导致了更加稳定的三聚体萎蔫酸C的形成。

粪生素中有两个反式萎蔫酸以头对头的方式通过肽键形成一个哌嗪二酮单位，还有一个反式萎蔫酸分子通过酯键连接到肟酸的碳末端基团上。

高铁色素（ferrichrome）与铁色素（Ferrichromes）相似。

高铁色素A和铁菌素都是包含有三个Nδ-乙酰-Nδ-羟基鸟氨酸和三个氨基酸所组成的环状六肽。

三个氨基酸分别是甘氨酸，丝氨酸或丙氨酸。

需要注意的是，高铁色素和粪生素是指其各自家族的特定成员。

1.3真菌铁载体的生物合成真菌铁载体大多是源于L-鸟氨酸的异羟肟酸盐型（Plattner and Diekmann，1994），不像细菌那样变化很大。

由于真菌异羟肟酸型铁载体相同的基本单位是N δ-酰基-Nδ-羟基-鸟氨酸，所以，它们的生物合成途径是非常相似的（Hider，1984；Mei and Leong，1994）。

1994年Plattner和Diekmann提出真菌铁载体大致的生物合成途径（Plattner and Diekmann，1994）（图1-2）。

首先是L-鸟氨酸在L-鸟氨酸-N-羟基化酶（L-ornithine-Nδ-hydroxylase）的催化下通过N-羟基化形成Nδ-羟基-L-鸟氨酸（Winkelmann，1992；De Luca 和Wood，2001）第二步是Nδ-羟基-L-鸟氨酸通过酰基化形成Nδ-酰基-Nδ-羟基-L-鸟氨酸（Plattner and Diekmann，1994）。