重组人胰岛素生产工艺.ppt

由于结构和性质的差异，胰岛素和生长激素的分离纯化过程有所不同，
涉及的步骤和技术也有所区别。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
要点一
酵母表达系统
要点二
低成本、高产出
酵母作为宿主细胞具有高表达、易培养、易发酵等优点， 有助于提高胰岛素的生产效率。
通过大规模发酵和分离纯化，可以实现低成本、高产出， 降低治疗费用。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，能够实现更接近人体 生理状态的糖基化过程，提高生长激素的生物活性。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
更接近人体天然结构
哺乳动物细胞表达的生长激素更接近 人体天然结构，降低了免疫排斥的风 险。
临床效果更佳
由于结构和性质的优化，重组人生长 激素在治疗某些疾病方面具有更好的 临床效果。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的异同点
01 02
原料与培养基
胰岛素生产主要使用酵母作为宿主细胞，而生长激素则更倾向于使用哺 乳动物细胞作为宿主。此外，培养基的成分也有所不同，以满足不同细 胞的需求。
蛋白质修饰
胰岛素和生长激素在蛋白质修饰方面存在差异，以适应其特定的生理功 能和药理作用。
03
分离纯化过程
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
生产成本高
哺乳动物细胞培养成本较高，导致生长激素的生产成本增加。
生产周期长
哺乳动物细胞生长缓慢，培养周期长，影响了生产效率。
潜在的病毒污染风险
虽然采用了各种病毒消除技术，但仍存在病毒污染的风险。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的发展趋势与展望
基因编辑技术应用
通过控制培养条件，如温度、pH、营养物 质等，优化细胞代谢，提高目标蛋白质的产 量。

—— 获得高纯度结晶胰岛素 Hans Christan Hagedorn, et al —— 合成鱼精蛋白锌胰岛素(PZI) Hans Christan Hagedorn, et al —— 合成中效胰岛素制剂（NPH）
Hagedorn，是PZI、NPH的主要发 明者，内科医师，博士，丹麦Steno 糖尿病中心创始人，兼任主任2116年
1788年 Thomas Canley (英) —— 证实胰腺损伤可导致糖尿病
1869年 Langerhans (德) —— 发现胰腺内具有分泌功能的细胞团
1889-1893年 Von mering 和 Minkowski (德) —— 证实胰腺细胞团产生降血糖物质
1893年 Edouard Laguesse (法) —— 将胰腺细胞团命名为胰岛
胰岛素(Insulin) -----糖尿病人的福音
张良程 13812018
1
目录
• 胰岛素的结构 • 胰岛素的生理作用 • 胰岛素的分类 • 胰岛素的研发史 • 长期注射胰岛素的副作用及危害 • 胰岛素的合理应用 • 中国胰岛素市场
2
胰岛素的结构
C肽
3
二肽连接 1
1
2Leabharlann 11A链赖氨酸
1
精氨酸
二肽连接
13
1965年 王应睐，邹承鲁，龚岳亭等 (中)
Katsoyannis PG (美) Meienhorer (德) —— 人工合成牛胰岛素
1967年 Donald F. Steiner (美) —— 发现胰岛素原
1969年 Dorothy Hodgkin (英) —— 确定胰岛素氨基酸排列的三维
空间结构
Collip (化学家)

END
重组人胰岛素生产工艺
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
•
7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (来自脚 的工人 总是说 工具不 好)。
•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃

重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，它参与调节葡萄糖代谢，维持血糖水平稳定。

然而，对于许多糖尿病患者，体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。

为了解决这一问题，重组人胰岛素制备工艺应运而生。

本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺，以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。

关键词介绍1、重组人胰岛素：是指利用基因工程技术，通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。

它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能，因此在临床上有广泛的应用。

2、制备：是指通过一系列工艺步骤，从原料中提取或制造出所需物质的过程。

在重组人胰岛素制备中，主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。

3、工艺：是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。

工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。

重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选：选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种，对其进行筛选和改良，以提高发酵过程中的产量。

2、基因工程操作：将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中，确保基因正确表达。

3、发酵：在适宜的营养条件下，利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。

4、分离和精制：通过一系列物理、化学和生物学方法，将重组人胰岛素从发酵液中分离出来，并进行精制和纯化，以得到高纯度的产品。

制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术，如响应面法和均匀设计法，筛选最佳工艺条件，以提高重组人胰岛素的产量和质量。

2、通过基因工程技术改良酵母菌，增强其生产重组人胰岛素的能力，提高产量。

3、采用先进的分离和精制技术，如高效液相色谱和超滤膜过滤等，进一步提纯产品，提高产品质量。

4、结合计算机模拟技术和实验验证，模拟工艺过程，指导实际生产，优化制备工艺。

重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义，本文详细介绍了其制备过程及优化方法。

通过合理选择工艺条件和基因工程改良，可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。

随着科学技术的发展，相信未来制备工艺将进一步优化，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。

对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品
重组人胰岛素生产工艺流程功能间分布
工序
功能间名称
主要操作
菌种
菌种室
菌种储藏
培养基准备间
培养基配制、消毒、无菌服消毒
接种室
在超净工作台中进行无菌接种，菌种并瓶
扩培室
菌种的摇瓶培养
菌种洗衣
菌种区无菌服清洗
发酵
发酵室
种子培养、发酵培养
控制室
发酵过程控制
发酵配料室
重组人胰岛素产品生产工艺流程
对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养
在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期
时转入发酵罐培养பைடு நூலகம்
分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌
体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表
达目的产物，HPLC检测目的产物含量
目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率
成品精纯化
精纯配液室
精纯化区配液
冷室
结晶产物低温静置
精纯化区
胰岛素成品精制、结晶
制备控制
制备色谱柱电脑控制
过滤冻干
过滤冻干室
成品无菌过滤、结晶水洗以及冻干
通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白
利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇
调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体
控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇
再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇
调节PH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II固体
发酵配料
固液分离
过滤室
发酵液过滤分离

4.B-XXX-A 重组表达 X为氨基酸
N≤3 Chain B X1X2 Chain A
Xn 冯佑民 张友尚 <<生物工程进 展>> 1998, Vol.16, No. 4
;.
9
重组人胰岛素基因工程菌的构建 重组前胰岛素
Chain B
Chain C
Chain A
;.
10
Materials
1.Restriction enzymes
22-162： E. coli ecotin
163-174：(Gly Ser)6 linker
175-180: LVPRGS
重组胰岛素 Recombinant Human Insulin
2007.10.30
;.
1
前言： 胰岛素的发现 胰岛素的结构 重组人胰岛素及类型
重组人胰岛素基因工程菌的构建： Construction of the ecotin(大肠杆菌素)–proinsulin expression plasmid Construction of pEGP1 plasmid
CGC GGT AGT CAC CAC CAC CAC CAC CAC CGT TTT GTG Arg Gly Ser His His His His His His Arg
AAC CAA CAC CTG TGC GGC-3’ Proinsulin
reverse primer
5’-AGT GTC GAC TTA GTT GCA GTA GTT CTC CAG CTG GTA-3’
from
Stratagene
5.E. coli GM2163 (dam- and dcm- )
from NEB

四、重组人工胰岛素
通过基因工程酵母菌E．coli发酵生 产hPI，经后加工形成hI。
4.1菌种制备
提取目的基因 提取质粒 基因重组
将质粒送回大肠杆菌 胰岛素的产生
4.2胰岛素的产生和精制（即菌种的 发酵培养）
重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工 技术在如今已经是炉火纯青。有近百年 的 发酵工程为基础，结合现在的基因工程技 术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程 更是可靠和安全的。
1996 胰岛素类似物
从动物胰岛素到人胰岛素是 胰岛素历史的极大进步，之 后动物胰岛素时代终结。
1987 人胰岛素 1973 单组分胰岛素
1953 长效胰岛素
1946 NPH 胰岛素 1923 动物胰岛素
1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
胰岛素的生产
从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个 氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体
半合成胰岛素 ----将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为
半合成人胰岛素
重组DNA技术生产人胰岛素
※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接 ※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素（广泛）
4.3药物检测
这种重组人工胰岛素的检测重点应该是 ① 测定生物活性 ② 效价测定 ③ 控制产品中杂质潜在有害物质 ④ 保证产品安全性和有效性
五、问题与展望
胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位， 但因注射给药让许多患者产 生畏惧心理，使其作 用发挥受到限制。
研究方向： 1.新的给药方式，例如:口服、吸入; 2.改变药物代谢机制; 3.改进注射手段，让使用者无痛; 这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。

➢ 药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。
➢ 目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相
比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易 产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的 苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
MIXTARD HUMAN 70/30
BAYER PHARMS
NOVOLIN 70/30 NOVOLIN L NOVOLIN N
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
基因重组来源的胰岛素（27种）
药品名称
生产企业
药品名称
生产企业
APIDRA EXUBERA
在 pH4～7 时，聚合成不溶解状态的沉淀
pH>9 时解聚并失活
4. 稳定性
Ins 在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定
还原剂及多种重金属使 Ins 失活
紫外线、光氧化、超声波会引起 Ins 变性。
➢ 胰岛素的功能 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋 白质合成的激素。
LENTARD LENTE
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
PROTAMINE ZINC AND ILETIN II
LILLY
PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK)
1970s----单峰胰岛素和 单组分胰岛素
70年代末----半合成胰岛素
1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。

生产企业
NOVO NORDISK INC
LILLY
INSULIN INSULIN INSULATARD NPH NORDISK INSULIN NORDISK MIXTARD (PORK) LENTARD
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
速效胰岛素
特点： • 起效快，皮下注射后15分钟起效。 • 达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。 • 药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。 药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似， 能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。
起效时间
常规皮下Ins: 30-90min 生理Ins： 0-20min
动物来源的胰岛素（28种）
药品名称
ILETIN I
ILETIN II
生产企业LILLYLILFra bibliotekY药品名称
NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN
PROTAMINE ZINC & ILETIN I (BEEF-PORK) PROTAMINE ZINC AND ILETIN II PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK) PROTAMINE ZINC INSULIN REGULAR ILETIN II
苏泌啉-- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩-- 低精蛋白重组人胰岛素注射液
3. 徐州万邦
万邦林-- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林—猪胰岛素制剂
其他（持有药品注册证）
---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化 制药厂、武汉生化制药厂 等

L iq W a s te 1 6
P-12 / V-111
Crystallization
S -1 7 2
P-33 / DF-104 L iq W a s te 1 5
Diafiltration
L iq W a s te 1 4
P-31 / C-105
Gel Filtration
P-29 / DF-1L0i3q W a s te 1 3
P-14 / DS-101
Centrifugation
再次离心， 去除菌体碎 片和可溶性 蛋白 共用前面回 收工段的碟 片离心机
反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个
氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin
WFI透析至盐 酸胍浓度为 20%w/w
pH 9-11，50%w/w(6M)盐酸
--菌液从37000L浓 缩到9165L菌泥 EDTA Solution S -1 3 8 --菌体收率98%
Primary Recovery Section
三次高压匀
浆机破菌释
放包涵体
L iq W a s te 2
压降800bar
终物料体积： 1400L
T ri to n-X-100
S -1 2 5
L iq W a s te 1 2
Diafiltration
P-28 / C-104
RP-HPLC
P-30 / DF-103
Diafiltration
Media
S -1 0 2
发酵工段
W ater
Fermentation Section
S-108 P-6 / AF-102
S -1 0 7

手术和应激状态：在手术或应激状态下，重组人 胰岛素可以作为葡萄糖代谢调节剂，维持血糖稳 定
重组人胰岛素生产工艺流程
第三章
基因工程菌培养
基因工程菌的选 择与构建
培养基的配制与 灭菌
基因工程菌的培 养条件与过程
培养过程中的注 意事项与质量控 制
基因工程菌发酵
基因工程菌的选择与构建
基因工程菌的培养条件
重组人胰岛素生产工艺中的 关键技术
第四章
基因工程菌的选择和培养条件优化
基因工程菌的选择：选择具有高表达量、稳定性和适应性的工程菌株
培养条件优化：通过控制培养基成分、温度、pH、溶氧等条件，提高工程菌的生长和表 达水平
发酵过程监控：实时监测工程菌的生长和表达情况，及时调整培养条件
分离纯化技术：采用高效液相色谱、凝胶过滤等方法对重组人胰岛素进行分离纯化，确 保产品质量
质量控制和 监管：加强 质量控制和 监管，确保 重组人胰岛 素的安全性 和有效性
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汇报人：
重组人胰岛素的应用
糖尿病治疗：重组人胰岛素是治疗糖尿病的主要 药物之一，可以降低血糖，改善糖尿病症状
胰岛素缺乏症治疗：对于胰岛素分泌不足的糖尿 病患者，重组人胰岛素可以替代体症如 酮症酸中毒和高渗性非酮症性昏迷的治疗 中，重组人胰岛素可以降低血糖，纠正代 谢紊乱
变质。
原材料使用：按 照规定的投料量 和使用方法进行 操作，确保原材 料在生产过程中 得到充分利用， 同时避免浪费和
污染。
生产过程的质量控制
原料质量控制：对原料进行严格筛选和检测，确保符合质量标准 生产过程监控：对生产过程中的关键步骤进行严格监控，确保产品质量 稳定 成品检验：对成品进行严格检验，确保符合质量标准

重组人胰岛素产品生产工艺步骤
对从菌种库中取出菌种进行活化及初步扩大培养
在种子罐中对菌种进行深入扩大培养，至菌种到对数生长久
时转入发酵罐培养 分两阶段进行控制，第一阶段关键经过控制溶氧和补加甘油使菌
体达成富集目标，第二阶段经过补加甲醇使菌体进行高密度表 达目标产物，HPLC 检测目标产物含量 目标产物存在于发酵液上清中，此步骤关键控制目标产物收率
经过两步柱层析，分别去除发酵上清液中色素和杂蛋白 利用紫外检测仪控制目标产物收率，关键试剂为乙醇和异丙醇 调整PH 值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I 固体
控温进行转肽反应，关键试剂为DMSO 和1,4-丁二醇
再经过柱层析进行提纯，关键试剂为异丙醇 调整PH 值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II 固体 经过控制湿度和温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素 关键试剂为丙酮，产品为半固体
经过两步柱层析对胰岛素进行提纯，试剂为Tris-HCl
和异丙醇
经过超滤对提纯后胰岛素进行浓缩，经过管道传输到下工序
经过制备色谱对胰岛素粗品进行精制，关键试剂为色谱乙腈然后经两步结晶后经过管道过滤除菌到百级区
对胰岛素成品进行一次结晶和水洗
对水洗后胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品
重组人胰岛素生产工艺步骤功效间分布。