第七章生物大分讲义子的色谱分离和纯化120319
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生物分离与纯化技术知识点归纳
生物分离与纯化技术知识点归纳生物分离与纯化技术知识点归纳在平平淡淡的学习中，不管我们学什么，都需要掌握一些知识点，知识点就是掌握某个问题/知识的学习要点。
哪些知识点能够真正帮助到我们呢？以下是店铺精心整理的生物分离与纯化技术知识点归纳，欢迎阅读，希望大家能够喜欢。
1、生化分离，生化分离技术的基本步骤生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。
来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难。
（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作。
2、吸附技术概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换）常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。
活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸附力大于相对分子质量小的化合物。
影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。
3、膜分离技术概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。
特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。
第七章 生物大分子的色谱分离和纯化
吸附色谱分离
是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 有氧化铝 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 新的吸附色谱技术有： 新的吸附色谱技术有：
色谱分离的分类
1. 按分离机理不同分类
吸附色谱分离（ Chromatography，AC） 吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC） 分配色谱（ Chromatography，DC） 分配色谱（Distribution Chromatography，DC） 离子交换色谱（ Chromatography，IEC） 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC） 凝胶色谱（ Chromatography，GC） 凝胶色谱（Gel Chromatography，GC） 亲合色谱（ Chromatography，AFC） 亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）
纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在 基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和 纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统 的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、 DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化 产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体 等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。
凝胶色谱
以凝胶为固定相， 以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术， 大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子 筛色谱（ Chromatography， 筛色谱（Molecular Sieve Chromatography， MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（ ）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 Chromatography，SEC）
生物分离工程 第七章 色谱技术
吸附色谱及其分类和基本原理
什么是分配色谱？
离子交换色谱的分类及应用
凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理
高效液相色谱的分离原理及应用
蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
色谱技术（分配色谱）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色
谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动
（3）线性洗脱法
线形洗脱法（linear gradient elution)
流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低， 移动速度逐渐增大
特点
难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱； 改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作 范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备
滤介质的要求和影响分离特性的因素
应用：掌握凝胶色谱的应用及特点
（1）定义
凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定 相，是根据料液中溶质相对分子量的差 别进行分离的液相色谱法
（2）原理
在GFC柱中，分子量大的溶质 不能进入凝胶介质，而沿介质 空隙流过 分子量很小的溶质能够进入所 有的细孔中，其洗脱体积接近 柱体积 分子两介于两者之间的溶质能 够进入部分细孔中
形状
纸色谱 薄层色谱 柱色谱 纸层析
薄层层析
（3）操作压力分类
低压液相色谱（<0.5 MPa）
中压液相色谱（0.5-4.0 MPa）
高压液相色谱（>4.0 MPa）
（4）流动相流动方式分类
轴向流色谱
径向流色谱
（5）分离操作方式分类
什么是分配色谱？
离子交换色谱的分类及应用
凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理
高效液相色谱的分离原理及应用
蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
色谱技术（分配色谱）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色
谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动
（3）线性洗脱法
线形洗脱法（linear gradient elution)
流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低， 移动速度逐渐增大
特点
难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱； 改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作 范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备
滤介质的要求和影响分离特性的因素
应用：掌握凝胶色谱的应用及特点
（1）定义
凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定 相，是根据料液中溶质相对分子量的差 别进行分离的液相色谱法
（2）原理
在GFC柱中，分子量大的溶质 不能进入凝胶介质，而沿介质 空隙流过 分子量很小的溶质能够进入所 有的细孔中，其洗脱体积接近 柱体积 分子两介于两者之间的溶质能 够进入部分细孔中
形状
纸色谱 薄层色谱 柱色谱 纸层析
薄层层析
（3）操作压力分类
低压液相色谱（<0.5 MPa）
中压液相色谱（0.5-4.0 MPa）
高压液相色谱（>4.0 MPa）
（4）流动相流动方式分类
轴向流色谱
径向流色谱
（5）分离操作方式分类
07 生化技术tan
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰 胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用 下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点： 1、一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好 2、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应 3、对pH和温度变化较稳定 4、几乎无电渗作用，样品分离重复性较好 5、样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10－6 g 6、凝胶孔径可调节 7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中
2、密度梯度离心法：常用介质有甘油、蔗糖、氯化铯（昂贵）
密度梯度仪
不同长度DNA停留在离心管不同高度 经密度梯度离心，样品纯度极高 3、柱层析与旋转柱层析： Sephadex-G50：去除很短核酸片段和dNTP, 纯化探针
各种提取、浓缩、分子量截留试剂盒
五、总蛋白质的分离纯化方法 1、破细胞 SDS等，超声波、低温研磨或匀浆、酶法
A3.3 A13.3 A13.3 B6.7 B26.7 B26.7 A1.1 A6.7 A13.3 A8.9
B2.2 B13.3 B26.7 B17.8 A0.37 A3.0 A8.9 A12 A5.9
B0.73 B6.0 B17.8 B24 B11.9 1.1 9.0 26.7 36 17.8
高效液相层析
二、生物大分子分离纯化的操作
特点：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制 备有以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极 易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物 大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、 pH值、离子强度等各种影响参数对溶液中各种组成的 综合影响，很难准确估计和判断。
生物分离与纯化技术(生化工艺)第7章 色谱分离技术
2013-9-13
第3节
离子交换色谱
二、离子交换色谱原理 离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，洗脱 液为流动相的色谱分离操作，由于不同物质电 荷性质、数量、强弱等不同，因而与离子交换 剂的固定电荷静电吸引力不同，使得其在固定 相、流动相分配不同，因此迁移速率不同而实 现对混合物的分离。
2013-9-13
任何色谱分离过程实 质上都是溶质随流动 相流动而迁移的过程 ，不同溶质在流动相 和固定相中的分配比 例不同，因而随流动 相迁移的速度不同， 从而使不同物质分离 开来。
2013-9-13
洗脱曲线
2013-9-13
5
• 色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平
衡时的一段柱高（塔板高度）
• 反映不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 柱高之间的关系 • 理论塔板数的计算方法：
[ — R A - ] [ B- ] Kp [ — R B- ] [ A - ]
2013-9-13
不同离子交换反应平衡常数不同，因 而荷点溶质分配在离子交换剂与水溶 液中的比例不同
第3节
离子交换色谱
一、离子交换概述 影响离子交换选择性的因素
（1） 离子电荷数（化合价） （2） 离子水合半径 （3） 离子电荷强弱
2013-9-13
第3节
离子交换色谱
一、离子交换概述 离子交换过程的本质及选择性
离子交换是离子交换剂上的反离子电离至水溶液中而溶液中其 他与固定电荷带有相反电荷的离子通过静电吸引力而被吸附在 固定电荷，其本质上是一个可逆化学反应（平衡反应）。
— R B－ A－ —R A－ B－
第7章 色谱分离技术
第1节 色谱技术基础 第2节 吸附色谱 第3节 离子交换色谱 第4节 凝胶色谱
医学生物分子的分离纯化PPT课件
第七章 生物分子的分离纯化
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在 于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
生物分子是生物所特有的有机化合物， 具有如下主要特征：
1）结构复杂有序、具有特殊的层次； 2）行使专一的功能； 3）代谢是其存在的条件； 4）生物分子体系具有自我复制的能力； 5）能人工合成与改造。
DNA
质 粒 的 提 取 与 纯 化
质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等
这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒 DNA的分离纯化三个步骤组成
1、碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂 SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质 与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。
分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污 染，保证核酸制品的纯度。
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构 还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有 机溶剂；
1. 回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA 样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。
2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化 的柱层析法（column chromatography）。
柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素 （cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在 于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
生物分子是生物所特有的有机化合物， 具有如下主要特征：
1）结构复杂有序、具有特殊的层次； 2）行使专一的功能； 3）代谢是其存在的条件； 4）生物分子体系具有自我复制的能力； 5）能人工合成与改造。
DNA
质 粒 的 提 取 与 纯 化
质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等
这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒 DNA的分离纯化三个步骤组成
1、碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂 SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质 与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。
分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污 染，保证核酸制品的纯度。
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构 还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有 机溶剂；
1. 回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA 样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。
2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化 的柱层析法（column chromatography）。
柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素 （cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。
色谱分离纯化与分析技术
色谱分离示意图 色谱法的特点是： ① 高分离效能：能分离分析性质相近的混合组分，如：同系物、同位素、同分异构 体、空间异构体等。能高效分离沸点相近或组成复杂的多组分混合物。 ② 高灵敏度：样品用量小，可分析 10-14 ～10-7 克数量级的物质，用于痕量分析。 ③ 分析速度快：可实现分离、分析一次完成，自动化程度高。 ④ 应用广泛：无论是无机物、有机物、高分子化合物，还是具有生物活性的生物大 分子，都可以选择不同的色谱方法进行分离和分析。普遍应用于化学、化工、医 学、环境、生命科学等多学科领域。 色谱法是 20 世纪初发展起来的一种分离分析方法，经过多年的发展，目前已经有多种 分离类型和操作方法。人们从不同角度，对色谱分离方法进行了如下分类： (1) 按两相的物理状态分类： 以气体为流动相的色谱称为气相色谱(gas chromatography, GC)：根据固定相是固体吸附 剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），气相色谱又可分为气固色 谱(gas-solid chromatography, GSC)和气液色谱(gas-liquid chromatography, GLC)。 以液体为流动相的色谱称液相色谱(liquid chromatography, LC)：同理液相色谱也可分为 液 固色谱 (liquid-solid chromatography, LSC) 和液 液色谱 (liquid-liquid chromatography, LLC)。 以超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱 (supercritical fluid chromatography, SFC)。 以化学反应将固定液键合到载体表面， 这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱 （bonded phase chromatography, BPC）。 (2) 按固定相的外型分类: 将固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，根据材质的不同又分为纸色谱 (paper chromatography, PC)和薄层色谱(thin layer chromatographu, TLC)。 将固定相装于色谱柱内的色谱法，称为柱色谱(column chromatography, CC)。色谱柱又 分为空心柱，填充柱或毛细管柱等等。
生物工程下游技术第七章_生物大分子的色谱分离和纯化
有关，塔板数越多，柱效能越高。
色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效
塔板数来表示。
1．理论塔板数n：
tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Y
2
tR
式中：tR为某组分的保留时间；
Y1/2为某组分色谱峰的半宽度； Y为色谱峰的峰底宽度。
由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间
有关。保留时间越长，峰越窄，理论塔板数就越
描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评 价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论 。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许
多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描
述组分在柱中的分配行为。该 理论成功
地解释了色谱流出曲线呈正态分布。
（一）塔板理论假定：
1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔 板体积加入。
在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！
h. 色谱峰的高度、宽度及面积：
标准偏差：峰高0.607 倍处峰宽度的一半。
半峰宽Y1/2：峰高一半处的峰宽。Y1/2=2.355
峰底宽Y：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间
的距离。Y= 4
峰面积A：色谱定量的依据。A=1.065hY1/2
,[A=1.065h(Y0.15+Y0.85)/2]。
Vr' ：某组份的保留体积扣 f. 调整保留体积 除死体积后的体积。
V Vr V0 t Fco
' r ' r
g. 相对保留值2,1或i,s ：组份2的调整保留值 与组份1的调整保留值之比。
生物分子的分离纯化课件
⑵ 其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定 RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
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2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求 建立相应的可靠的分析测定方法
科研、开发或 发现新的物质
制备的关键
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验
掌握目的产物 的理化性质
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
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（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
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2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
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生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求 建立相应的可靠的分析测定方法
科研、开发或 发现新的物质
制备的关键
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验
掌握目的产物 的理化性质
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生物大分子分离纯化技术之层析(色谱)技术(56页)
生物大分子分离纯化技术
当流动相中所含的混合物经过固定相就会与固定 相发生作用。由于混合物中各组分在结构和性质上存 在差异，它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差 异。因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留 时间不同，从而按先后不同次序从固定相中流出。这 种借在两相间分配的原理而使混合物中各组分离的技 术，称为色谱分离技术或色谱法，又称色层法、层析 法。
生物大分子分离纯化技术
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实 的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也 不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论 认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建 立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有 径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的， 因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、 峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地 解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰 型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温及 常压下进行起来，又补充了气相色谱法的内 容。根据液相色谱的特点，可称做高效、高压、高速和现 代液相色谱法。液相色谱法不论在仪器还是柱填料方面均 发展很快。
生物大分子分离纯化技术
层析（色谱）法分类
样品中的离子与离子交换树脂上的离子的交换反应过程可用下式表示：
阳离子交换
树脂-SO3-H++M+ 阴离子交换
树脂-SO3-M++H+
树脂-NR3+Cl-+X- 树脂-NR3+X-+C1-
生物大分子分离纯化技术
(四)空间排阻色谱法 (五)亲和色谱法
生物大分子分离纯化技术
塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论， 塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待 分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每 一个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动，组 分分子不断从一个塔板移动到下一个塔 板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱 的塔板数越多，则其分离效果就越好。
生物大分子分离纯化-原理与技术
MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM
Bio-Beads S-X介质
➢亲和层析
➢羟基磷灰石介质（CHT）
Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质
CHT 羟基磷灰石
层析原理与操作
• 最广泛的蛋白质分离纯化方法 – 条件温和 – 维持蛋白质空间结构与活性
• 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 • 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离
8 精品课件
2020/8/16
层析的5个操作步骤
• 装柱并平衡 • 上样 • 平衡 • 洗脱 • 再生
50.0 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.0 -0.010
00:00:00 AU
5 精品课件
Fractions
01:00:00
Hr:Min:Sec
02:00:00
2020/8/16
0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 -0.050
19精品课件
2020/8/16
层析介质结构原理
Unosphere MacroPrep
离子交换层析 Q，S，DEAE，CM
Unosphere Q, S MacroPrep High Q, S MacroPrep DEAE, CM
Vt
有时这里也显示梯 度浓度等检测值
基线
时间或体积，x轴
第七章生物大分子的色谱分离和纯化120319-PPT文档资料
第七章生物大分子的色谱分离和纯化120319
精品着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。
复习
防止膜污染的方法
（1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便
易受离子干 各种生物大分
扰
子的分离、脱
色、和去热源
凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分 辨 力 高 ， 不 各 种 凝 胶 介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质 昂 贵 ， 处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子
固定相的物理特性
物理特性
名称
板状 纸
一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压
平板色谱 纸色谱
薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱
气体
液体 固体
气相色谱
根柱子 柱色谱(气相)
气液色谱 分配系数 气液分配色谱 填充紧密 填充柱色谱
气固色谱 吸附能力 气体吸附色谱 空心管壁 空心柱色谱
分配色谱 溶质在固定相和流 分 辨 力 高 ， 重 影 响 因 子 多 ，用 于 各 种 生 物
动相中分配系数的 复 性 较 好 ， 能 上样量太小 大 分 子 的 分 析
差异
分离微量物质
鉴定
亲和色谱 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力
一种配体只 各种生物大分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大
精品着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。
复习
防止膜污染的方法
（1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便
易受离子干 各种生物大分
扰
子的分离、脱
色、和去热源
凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分 辨 力 高 ， 不 各 种 凝 胶 介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质 昂 贵 ， 处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子
固定相的物理特性
物理特性
名称
板状 纸
一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压
平板色谱 纸色谱
薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱
气体
液体 固体
气相色谱
根柱子 柱色谱(气相)
气液色谱 分配系数 气液分配色谱 填充紧密 填充柱色谱
气固色谱 吸附能力 气体吸附色谱 空心管壁 空心柱色谱
分配色谱 溶质在固定相和流 分 辨 力 高 ， 重 影 响 因 子 多 ，用 于 各 种 生 物
动相中分配系数的 复 性 较 好 ， 能 上样量太小 大 分 子 的 分 析
差异
分离微量物质
鉴定
亲和色谱 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力
一种配体只 各种生物大分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大
生物大分子分离纯化的方法01
选择填料时，最好是选择琼脂糖凝胶系列的产 品，避免选择纤维素类的或者sephadex类的， 因为它们流速慢而且不能在柱子上进行再生清 洗，操作不便。如果采用线性洗脱的方法使用 细长柱子及颗粒细的HP级别的填料可以得到更 好的分离效果。
(3) 疏水色谱
1、原理
疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography HIC）原理是 在高浓度的盐溶液中，蛋白质会被吸附 到疏水色谱填料的疏水基团上，当逐渐 降低盐浓度时，它们会按疏水性的强弱 先后被洗脱。
疏水相互作用色谱的原理
2、 疏水色谱的影响因素
1） 色谱填料的影响
1. 色谱填料只有疏水相互作用力。 2. 疏水基团的密度必须适中。 3. 疏水基团碳链不应该太长。
2） 缓冲液的影响 1. 缓冲液的盐浓度。
2. 在洗脱缓冲液中有机溶剂的影响。 3. 起始缓冲液的盐浓度对分辨率有决定作用。
3） pH值的影响
镍琼脂糖凝胶 FF分离带His标签的重组蛋白
800
A280(mAu)
600 400 200 0 0
穿透峰
1 2 3
4
40
80 120 time(min)
160
图1镍柱色谱图
柱子： 镍琼脂糖凝胶 FF 1.6x20 10 ml 样品：13.5ml细胞破碎液 平衡缓冲液：20mM PBS pH 7.4 0.5M NaCl 洗脱缓冲液:平衡缓冲液中加不同浓度的咪唑
(4) 亲和色谱
1、原理
亲和色谱(Affinity Chromatography AC)又 叫功能色谱(Function Chromatography)， 它的原理是填料上的配基与生物大分子特 异结合，用特殊的洗脱条件把被吸附的生 物分子洗脱下来。一种亲和色谱填料只能 用于一种或有限的一类生物分子。
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第七章
生物大分子的色谱分离与纯化
第一节 色谱概论
一、色谱的概念
色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、 亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色 层分离。
二、色谱的特点
1. 能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分 离并检测出来。
2. 它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止 的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配 系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经 过就连是续色多谱次法在所两 依相据中的的基质本量原交理换。充，分从条而件使不同组分得以必分要离条，件这
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便
易受离子干 各种生物大分
扰
子的分离、脱
色、和去热源
凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分 辨 力 高 ， 不 各 种 凝 胶 介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质 昂 贵 ， 处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子
1.5 层析剂种类
⑴氧化铝 ⑵硅胶 ⑶活性炭 ⑷琼脂糖 ⑸ 纤维素
• 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物 制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲 和色谱等。选择的原则：
1. 易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；
2. 水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交 换色谱；
2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点
色谱分离图示
根据混合物中，溶质在 互不相溶的两相之间分 配行为的差别，引起溶 质移动速度的不同而进 行分离的方法。
互不相溶的两相分别称 为：固定相和流动相。
色谱分离图示
三 、层析的分类
• ⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类
离子交换色层分离法
吸附层析法 分配层析法
操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同
固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层
流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态
将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。
第七章生物大分子的 色谱分离和纯化 120319
复习
膜的污染
膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。
复习
防止膜污染的方法
（1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速
聚焦色谱 等电点和离子交换 分辨力高 作用
进 口 试 制 昂 蛋白质和酶 贵
三、色谱的分类
两相物理状态
流动 固定相 名 称 相
液相
液相色谱
液相 液液色谱
固相 液固色谱
作用机理
原理
名称
分配系数 吸附能力 分子大小 离子交换 能力 亲和力
液液分配色谱 液固吸附色谱 凝胶渗透色谱 离子交换色谱
亲和力色谱
疏水作用色层分离法 金属螯合色层分离法 共价作用色层分离法
凝胶过滤法
⑵ 根据实验技术的分类
低压层析技术 ——操作压力小于0.5MPa
中压层析技术 ——操作压力在0.5MPa-5MPa之间
高压层析技术 ——操作压力在5Mpa-40MPa之间
电泳法
——靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离
低压 0.5MPa 中压0.5 ~ 4.0MPa
固定相的物理特性
物理特性
名称
板状 纸
一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压
平板色谱 纸色谱
薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱
气体
液体 固体
气相色谱
根柱子 柱色谱(气相)
气液色谱 分配系数 气液分配色谱 填充紧密 填充柱色谱
气固色谱 吸附能力 气体吸附色谱 空心管壁 空心柱色谱
3. 样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。
• 除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子 中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。
为何选择色谱作为生物分子纯化方法？
✓不产生热 ✓不产生外力 ✓高回收率 ✓高分辨率 ✓线性放大，可预期 ✓可自动化 ✓大量成功例子
Principles of Operation for Chromatography Techniques
据实验技术
据固定相的形状不 同 据流动相的物态不 同 按操作方式不同
类型
吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱
低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
迎头法
顶替法
洗脱法
特征
吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同
常用于大量制备分离
高压4.0 ~ 40MPa 主要用于成分分析
⑶ 根据固定相的形状不同的分类：
柱层析法 纸层析法 薄层层析法
⑷ 根据流动相的物态不同的分类
汽相层析法
液相层析法
⑸ 操作方式不同的分类
迎头法 顶替法 洗脱分析法
层析分类
分类原则 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同
分配色谱 溶质在固定相和流 分 辨 力 高 ， 重 影 响 因 子 多 ，用 于 各 种 生 物
动相中分配系数的 复 性 较 好 ， 能 上样量太小 大 分 子 的 分 析
差异
分离微量物质
鉴配体之间有特 殊亲和力
一种配体只 各种生物大分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大