FA-VD-105 稀苯扎溴铵溶液微生物限度检查方法验证方案

最新版中国药典微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC 组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定2015.10.22目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。

参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。

通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。

人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。

甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。

本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。

本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1.供试液的制备1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。

备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.菌液制备2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。

加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。

河北瑞晶康生物科技有限公司//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////编码：VAP-MV-QC09版本号：00题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：1/27题目：消毒剂微生物限度方法验证方案起草人起草日期批准人批准日期颁发部门生效日期领用部门复印号分发部门审核小组成员河北瑞晶康生物科技有限公司//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////编码：VAP-MV-QC09版本号：00题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：2/27文件修订史：版本号变更xx→xx修订人原版失效日期新版生效日期修订原因修订内容-原版新版对比备注题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：3/27正文：★ 目的为了建立消毒剂的微生物限度检查方法，确认该方法适合于消毒剂的细菌、霉菌、酵母菌。

照此检查法和检验条件进行消毒剂细菌、霉菌、酵母菌能保证检验结果的准确、可靠。

★ 适用范围适用于消毒剂的微生物限度检查方法的验证。

★ 职责1.验证领导小组职责1.1 负责验证方案的审批。

1.2 负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。

1.3 负责验证数据及结果的审核。

1.4 负责验证报告的审批。

1.5 负责再验证周期的确认。

2.机械动力部职责2.1 负责组织试验所需仪器、设备的验证。

2.2 负责仪器、仪表、量具等的校验。

3.质量控制部/质量保证部职责3.1 负责拟订验证方案。

3.2 负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。

3.3 负责取样及对样品的检验。

3.4 负责收集各项验证、试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。

★ 描述概述：微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

复方碘溶液微生物限度检查方法验证方案1目的根据《中国药典》2015版草案中的相关规定，建立复方碘溶液的微生物限度检查方法，并对其进行验证,保证其检验方法的科学性，使检验结果准确可靠。

2范围本验证方案适用于复方碘溶液的微生物限度检查方法的验证。

3人员与职责质量控制人员负责验证方案与报告的起草,并按照批准的方案实施，完成检验相关数据的采集；质量保证人员负责验证方案和报告的审核；质量管理负责人负责验证方案和报告的批准.4培训本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。

5验证方案5.1制剂信息复方碘溶液为碘在碘化钾的助溶作用下溶于水中配制而成，处方中含有的碘有一定的抑菌作用，临床常作为口服补碘剂使用.其质量标准中规定应进行微生物限度检查,每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出大肠埃希菌.根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》（1105)和《非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用稀释剂制备成1﹕10的供试品溶液；采用平皿法中的倾注法对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的大肠埃希菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。

5.2微生物限度检查法概述5.2.1微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。

5.2.2微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出.单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

微生物限度检查操作规程微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠1.目的微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠建立一个微生物限度检查（包括细菌、霉菌、酵母菌）标准工作程序，规范QC微生物限度检查人员的微生物限度检查操作。

微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠2.范围微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠适用于本公司的细菌、霉菌、酵母菌的限度检测。

微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠3.责任者微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠QC微生物限度检查人员；质量管理部微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.内容微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1检测准备微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1.1 QC人员接到微生物限度检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定微生物限度检查所需的容器具、试液、培养基等的项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行微生物限度检查前的准备工作。

霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8.附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。

(3)．“无”为标准依据或无相应规定。

据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12）、培养皿（∮9 ）、量筒（100 ）、试管（18×180）及塞、吸管（1分度0.01，10 分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于12%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。

用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。

微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。

4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

药品微生物限度检查方法验证方案2014年1月15日方 案 审 批1方案起草2方案会签 3方案批准 4方案实施目录1. 概述2. 仪器设备3. 供试液的制备4. 细菌、霉菌及酵母菌计数5. 控制菌检查6. 验证品种项目表1微生物限度检查法概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

除另有规定外，本检查法中细菌的培养温度为30～35℃，真菌、酵母菌的培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为（36±1）℃。

检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml为单位报告。

检验量即一次试验所用的供试品。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的三倍量供试品。

2 仪器设备2.1 YXQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器2.2 双人净化工作台2.3 150A型培养箱2.4 HH.B11-500型培养箱2.5 202-2型干燥箱2.6 微波炉2.7 架盘天平2.8 YJA-电动匀浆仪3 供试液的制备根据供试品的理化特征与生物学特征，可采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需要用水浴加热时，温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。

固体供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10供试液。

审批及颁发：会审：分发：一、目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。

二、范围本公司注射用水及纯化水的微生物限度检查。

三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1概述：按照中国药典2010版（第二部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，验证所采用的方法和条件适合于供试品的微生物限度检查。

2验证项目3 验证时间安排3.1 2013年04月01日至 2013 年04月05日制订、审核及批准验证方案；3.2 2013年04月06日至 2013 年04月 15日实施验证3.3 2013年04月16日至 2013年04月 20日写出验证报告4 验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 验证人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认结论:检查人/日期：复核人/日期：4.3菌液制备4.3.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20～25℃培养24～48h。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100CFU的菌悬液。

4.3.2接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子溶液。

4.4培养基及稀释液与供试液4.4.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌，即得。

微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。

保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。

3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。

5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。

验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。

适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。

6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。

具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。

编号：苯扎溴铵溶液工艺验证报告版本： 0制定人：制定日期：审核人：审核日期：批准人：批准日期：一、目的：通过对验证数据的计算、分析，以技术报告的形式对验证结果进行汇总，并根据验证的最终结果作出结论。

二、描述：工艺验证是按照已批准的生产工艺规程及各种操作规程，在特定的监控条件下进行的连续三批以上的试生产，以期从过程参数及产品特性方面进一步证实生产工艺能平稳地、连续地进行，具有良好的重现性和可靠性。

本次验证是按照批准的验证方案进行实施的。

由生产管理部严格按照苯扎溴铵溶液生产工艺规程及各种操作规程，连续生产三批苯扎溴铵溶液，通过对搅拌时间、混合均一性、装量等进行验证，并对检测结果进行总结，以期证明该工艺符合设计要求。

三、范围：适用于苯扎溴铵溶液的生产工艺验证。

四、验证报告制订依据：《兽药生产质量管理规范》（2002年版）《兽药生产质量管理规范》培训指南五、验证方案实施情况验证工作小组严格按已批准的方案中所规定的内容对苯扎溴铵溶液生产工艺进行验证。

由生产管理部下达生产指令，组织生产；质量管理部组织质量检验人员对生产过程进行监控、取样分析，并由生产部汇总验证资料，出具正式验证报告。

具体时间如下：第一批生产：年月日生产批号：第二批生产：年月日生产批号：第三批生产：年月日生产批号：6.验证测试及其结果：6.1测试名称：配制系统验证（混合时间、均匀度）6.1.1 混合时间验证搅拌时间验证投料时先将饮用水总量的50%泵入配料缸中，然后按生产配方依次投入全部原料苯扎溴铵搅拌使溶解、混合，加饮用水至全量，开始计时搅拌10、15、20、25分钟。

并保证配液灌的装量不超过该机总量的2／3。

6.1.1.1验证目的设定不同的搅拌时间，对搅拌后的半成品均匀度进行检查，评估产品的混合均一性，挑选出最佳搅拌时间。

6.1.1.2 测试方法第一批随机选取5个取样点进行取样（取样点尽可能地分布均匀）。

设定4个不同的混合时间10min、15min、20min、25min，对各个时间点进行取样分析。

益母草颗粒微生物限度检查方法验证按照《中国药典》2005年版附录对微生物限度检查的要求，采用常规法对益母草颗粒进行微生物限度检查方法的验证，确认所采用的方法适合于益母草颗粒的微生物限度检查，即确认益母草在该检验量，该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计，以保证检验结果准确，可靠及检验方法的完整性。

结果表明，益母草颗粒无抑菌作用，常规法对无抑菌作用的益母草颗粒进行微生物限度检查的结果可靠，准确。

标签：益母草颗粒；微生物限度检查；方法验证药品微生物限度检查是控制药品微生物污染的重要手段，包括细菌，霉菌及酵母菌计数及控制菌检查，是药品安全性的重要指标之一。

随着药品剂型的日益发展和药品标准的不断提高，及时有效地进行药品微生物限度检查是摆在药检工作人员面前的重大课题。

药品微生物限度检查方法为《中国药典》1995年版首次收载，并在《中国药典》2005年版增订了方法验证实验，为药品微生物限度检查结果的可靠性提供了保障。

在做微生物限度检查时，经常发现有抑菌作用，那么对有抑菌作用的药物按常规法做微生物限度经常药品，以确认所采用的方法适合该样品的微生物限度检查。

本文结合执行《这个药典》2005年版及《美国药典》28版，《英国药典》2002版有关微生物限度检查法，按照中国药品检验标准操作规范及有关文献，以益母草颗粒为例。

益母草颗粒为治疗月经量少，产后腹痛的药物，具有活血调经的功效。

药品中含有益母草一味中药材成分，固益母草没有抑菌作用，可采用常规法进行实验研究，最终确定采用常规法进行细菌数，霉菌数及酵母菌数的测定，采用常规法进行控制菌的检查，经对所采用的方法进行验证，符合2005年版《这个药典》二部附录ⅪJ有管微生物限度检查法有关规定，方法可行。

益母草为唇形科植物益母草的干燥全草，又名茺蔚，益母蒿，坤草，月母草，地母草等，原生于山野荒地，田埂，河滩，草地，路旁，溪边等处，全国各地均有分布，部分地区有栽培，是常用的中药材品种。

专利名称：苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法专利类型：发明专利
发明人：孙毅,陈莹,金丽,刘赫
申请号：CN201710531728.0
申请日：20170703
公开号：CN107164454A
公开日：
20170915
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法，包括以下步骤：取苯扎氯铵溶液，加入稀释液，制成1:10供试液；用无菌吸头吸取1份供试液，加入到50份稀释液中，混匀；先用少量冲洗液润洗低吸附性滤膜，再采用薄膜过滤法将稀释后供试液全量过滤，用冲洗液分次冲洗滤膜，每次的冲洗量为总冲洗量的1/16；同法制备两张滤膜，分别贴于两种不同的培养基上，适宜条件培养后，点计菌落数；阴性对照：采用薄膜过滤法将稀释液进行过滤，菌面朝上贴于培养基上培养。

本发明的试验方法科学，试验结果准确，有效的降低了苯扎氯铵溶液的抑菌性，填补了苯扎氯铵原料微生物限度检查方法的空白，具有广阔的应用前景。

申请人：中国大冢制药有限公司
地址：300382 天津市西青区精武镇津文公路36号
国籍：CN
代理机构：天津市宗欣专利商标代理有限公司
代理人：孙乔乔
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