PCR需要注意的一些问题
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PCR需要注意的一些问题
扩增长目的片段
当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3'-5'外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。
除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基得到较好的产量。
防止残余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
PCR产物纯化
残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。Maligen
Rapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。
图26. 扩增后PCR片段的纯化
使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。引物36到40碱基长。将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。
部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。
PCR产物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。
但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit） 利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
图32 The TA Cloning? Concept
Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）
Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。
Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。
Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。
1. Add 1ml of TOPO? Cloning
vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product 2. Incubate for 5
minutes on your
bench top 3. Transform One
Shot? Competent E.
coli.
Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning
Kit）
因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。
Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。
平端PCR克隆方法（Zero Blunt PCR Cloning Kit）
Zero Blunt PCR克隆乃利用传统T4连接酶方法，但载体和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。
表10 PCR克隆试剂盒的选择
Amplification
Enzyme Application of Cloned
PCR Product Ligation Method Product Advantages Cat. No. Taq DNA
Polymerase ?Sequencing?Safeguarding
sample?In vitro
transcription TOPO? Cloning(5
minutes)
Topoisomerase TOPO TA
Cloning?
Kit ?≥95%
recombinants K4500-01K4550-01K4560-01 ?Blue/white
color screening
TOPO TA
Cloning?
Kit Dual
Promoter ?≥95%
recombinants
K4600-01K4650-01K4660-01 ?Blue/white
color screening
?Dual Sp6 and T7
promoter primer
sites for in
vitro
transcription
TOPO TA
Cloning?
Kit for
Sequencing ?≥95%
recombinants
K4575-01 ?Streamlined
sequence
analysis
Ligase-mediated(overnight)T4
DNA ligase Original
TA
Cloning?
Kit ?≥80%
recombinants K2000-10K2030-10 ?Blue/white
color screening
Original
TA
Cloning?
Kit Dual
Promoter ?≥80%
recombinants K2050-01K2060-01 ?Blue/white
color screening
?Dual Sp6 and T7 promoter/primers
sites for in
vitro
transcription
TOPO? Cloning(5
minutes)
Topoisomerase Various ?Fast cloning
directly into an
expression
vector All the
TOPO
Exp.
Kits
Proofreading
polymerase高确限度酶 ?Expression of cloned
PCR product TOPO? Cloning(5
minutes)
Topoisomerase Zero
Blunt?
TOPO? PCR
Cloning
Kit ?≥95%
recombinants
K2800-20 ?Positive
selection
resulting in low
background
Zero
Blunt?
TOPO? PCR
Cloning
Kit for
Sequencing ?≥95%
recombinants
K2875-20 ?Positive
selection
resulting in low
background
?Streamlined
sequence
analysis
Ligase-mediated(1
hour)T4 DNA ligase Zero
Blunt? PCR
Cloning
Kit ?≥95%
recombinants
K2700-20
?Positive
selection
