02-苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析
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18卷5期2002年9月生 物 工 程 学 报ChineseJournalofBiotechnologyVol.18 No.5September 2002
收稿日期:2002203221,修回日期:2002206211。基金项目:国家自然科学基金项目(No.39970423)和国家863计划课题(No.2001AA214011和2001AA212301)资助。3通讯作者。 Tel:86227287285679;E2mail:ziduo@ima.org.sg苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
基因的克隆及表达分析
蔡启良 刘子铎3 孙 明 魏 芳 喻子牛
(华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉 430070)
摘 要 选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种(subsp.Leesis)菌株YBT2833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai)菌株YBT21416和库斯塔克亚种(subsp.Kurstaki)菌株YBT21535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经
XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、
vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将
vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌2大肠杆菌穿梭载体pHT315,分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB89012171,BMB89022171,BMB890124Q7和BMB890224Q7。SDS2PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC50值
分别为28.6,31.6,45.4和37.6μLΠmL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。
关键词 苏云金芽胞杆菌,营养期杀虫蛋白,基因克隆,棉铃虫,小菜蛾,甜菜夜蛾中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号100023061(2002)0520578205
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringienesis)是一种
革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期间可产生包括δ2内
毒素(即杀虫晶体蛋白,简称ICP)在内的晶体包含
体。这类包含体能够在昆虫中肠上皮细胞溶解并释
放δ2内毒素,接着,在肠道内环境特异条件下降解毒
蛋白产生活性肽,活性肽可与肠道受体结合形成膜
穿孔,导致昆虫患败血症而死亡,从而表现出特异性
的杀虫毒力[5]。迄今为止,已经鉴定了许多不同杀
虫谱的苏云金芽胞杆菌菌株,它们产生的δ2内毒素
也已经被广泛地用来制备杀虫剂。在防治害虫转基
因植物方面也取得了很大的成效。部分转基因植物
(如转BT棉和转BT玉米)亦已商品化[6],挽回了农
作物虫害造成的巨大经济损失。
但是,在实际应用中仍有许多重要农作物害虫
对杀虫晶体蛋白毒素不敏感;另外,苏云金芽胞杆菌
制剂的长期广泛使用,也已经引起了自然界中部分
昆虫的抗性产生。最新研究发现,在苏云金芽胞杆菌的对数生长前期存在着一种大量表达的可溶性胞
外蛋白,即营养期杀虫蛋白(Vegetativeinsecticidal
protein,VIP)[1]。该蛋白对一些对杀虫晶体蛋白不敏
感的昆虫(如小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、烟蚜
夜蛾等)具有广泛杀虫活性。营养期杀虫蛋白的发
现弥补了杀虫晶体蛋白的不足,为更加有效地使用
杀虫晶体蛋白提供了优化的可能。
然而,由于目前仅有vip3A(a)、vip3A(b)和
vip2s3个基因,对营养期杀虫蛋白在苏云金芽胞杆
菌中存在的位置、意义和作用、以及其杀虫机制和进
化途径,尤其是营养期杀虫蛋白是否与杀虫晶体蛋
白一样存在多种亚群和亚类等尚不清楚[1,2],因此,从不同种属中或同一种属的不同个体中克隆营养期
杀虫蛋白基因,分析营养期杀虫蛋白在不同苏云金
芽胞杆菌中的存在情况,是非常必需的。此外,测定
营养期杀虫蛋白对其它害虫的毒力高低,对于提高
工程菌杀虫毒力,扩大杀虫谱等都具有一定的应用价值。本论文从本室分离的不同菌株出发,克隆得
到了3个营养期杀虫蛋白基因,并且对其进行了序
列比较和一些杀虫晶体蛋白不易感病昆虫的杀虫毒
力分析。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
本实验所用菌株和质粒见表1。
1.2 培养基菌株的培养采用LB、TB液体培养基。E.coli菌株在37℃培养,Bt.菌株在28℃培养。抗生素终
浓度分别为:氨苄青霉素,100μgΠmL;红霉素,25μgΠmL。
1.3 Southern杂交和菌落原位杂交均参照文献[3]
1.4 营养期杀虫蛋白vip基因PCR分析
特异上游引物:5′2TGTTACAAAAAACAGCTGAA2
3′;下游引物:5′2GATGGATCCCGATCTTACTT23′
表1 菌株和质粒Table1 Strainsandplasmids
Strainsandplasmids Characteristics SourcesStrains B.thuringiensis YBT2833 subsp.LeesisH33 serotype,wildtypestrainScreenedbyourLab. YBT21416 subsp.AizawaiH7 serotype,wildtypestrainScreenedbyourLab. YBT21535 subsp.KurstakiH3ab serotype,wildtypestrainScreenedbyourLab. 4Q7 subsp.IsraelensisH14 serotype,cry-mutatedstrainFromDr.H.Dean BMB171 subsp.KurstakiH3ab serotype,cry-mutatedstrainScreenedbyourLab. Non2plasmidmutatedstrainofYBT1463
Plasmids pUC19 pHT315 pBMB8601 pBMB8602 pBMB8603 pBMB8901 pBMB8902E.colicloningvector,AmpR
E.coli2Btshuttlevector.ErmR,AmpR
Vip83insertedintopUC19,AmpR
Vip14insertedintopUC19,AmpR
Vip15insertedintopUC19,AmpR
Vip83insertedintopHT315,ErmR,AmpR
Vip14insertedintopHT315,ErmR,AmpRStoredinourLab.FromPasteurInstituteD.LereclusThisstudyThisstudyThisstudyThisstudyThisstudy
Recombinantstrains BMB89012171 BMB89022171 BMB890124Q7 BMB890224Q7pBMB8901transferredintoreceptorBMB171pBMB8902transferredintoreceptorBMB171pBMB8901transferredintoreceptor4Q7pBMB8902transferredintoreceptor4Q7ThisstudyThisstudyThisstudyThisstudy
PCR扩增条件为:94℃1min,50℃1min,72℃2min,
25个循环。
1.5VIP蛋白质SDS2PAGE分析[1]
VIP蛋白质样品制备:B.thuringienesis工程菌株
在TB培养基、30℃培养36h,5000g离心2min,上
清液加入20mmolΠL柠檬酸钠(pH2.5)滴定到
pH415,在室温放置30min后,样品在8000g离心10
min,蛋白沉淀重新溶解于250mmolΠLNaCl溶液。
1.6 生物测定[4]
用棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾三龄幼虫进行生
物测定。
待测样品为工程菌发酵液经5000g离心1min
后的上清液。2 结果与分析
2.1 营养期杀虫基因在总DNA酶切片段中的定位
根据已知营养期杀虫蛋白基因设计特异引物,抽
提菌株YBT2833、YBT21416和YBT21535的总DNA,分
别进行PCR扩增,均得到2.4kb大小的特异扩增带
(资料未给出)。回收3种特异扩增DNA片段,混合
后用地高辛标记作为杂交探针。将抽提的3种总
DNA分别用限制酶XbaI、EcoRI完全消化,凝胶电泳
并转移到硝酸纤维素滤膜上,进行Southern杂交(见
图1)。结果表明,营养期杀虫蛋白基因在3种菌株总
DNA酶切片段均定位在XbaI消化的约4.
4kb或
EcoRI消化的约5.0kb的DNA片段。9755期蔡启良等:苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析2.2 vip83、vip14和vip15基因克隆与序列分析
为减少缩小基因片段的工作量,选择3种菌株
YBT2833、YBT21416和YBT21535的总DNA经XbaI
消化后的4～5kbDNA片段,分别插入pUC19的
XbaI位点,建立了3种菌株的亚基因组文库。经菌
落原位杂交筛选,PCR和酶切鉴定,分别得到来自
YBT2833、YBT21416和YBT21535的VIP克隆子pB2
MB8601、pBMB8602和pBMB8603(如图2A1,2,3所
示),所含营养期杀虫蛋白基因分别命名为vip83、
vip14和vip15。对所得到的3个基因进行了DNA序
列测定,并通过网上BLAST软件序列比较,发现基
因vip14和vip15与已报道的营养期杀虫蛋白基因
vip3A(a)序列相同,而基因vip83则与目前仅有的3
个营养期杀虫蛋白基因存在5个差异位点:其中与
vip3A(a)基因比,有3个位点不同,即C851→A851,
C852→A852和C2307→T2307。C851→A851的差异并未改变
所编码的氨基酸残基,C852→A852引起Gln284→Lys284
的变化,而C2307→T2307引起Pro804→Ser804变化;与
vip3A(b)基因比,存在两个碱基差异,即C870→A870
和G1215→A1215。C870→A870引起了Pro291→Thr291变化,
而G1215→A1215引起了Gly406→Glu406变化;与vip2s基
因比,不同的两个位点是C851→A851和G2223→A2223,其
中C851→A851由于密码简并性氨基酸未发生改变,而
G2223→A2223引起了Gly742→Glu742变化。vip83基因
DNA序列已在GenBank中登录,序列号为
AY044227。
图1 营养期杀虫蛋白基因在总DNA酶切片段中的定位Fig.1 Site2detectionofvipgeneinfragmentsoftotalDNAdigestedbyenzymes1.YBT2833’stotalDNAΠEcoRⅠ;2.YBT2833’stotalDNAΠXbaⅠ;3.YBT21416’stotalDNAΠEcoRⅠ;4.YBT21416’stotalDNAΠXbaⅠ;5.YBT21535’stotalDNAΠEcoRⅠ;6.YBT21535’stotalDNAΠXbaⅠ
