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![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s1/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
2024年电路实验个人心得体会在2024年的电路实验课程中，我学到了许多关于电子元件和电路工作原理的知识。
通过上课听讲和实验操作，我对电子技术有了更深入的了解，同时也培养了我的实验能力和解决问题的能力。
以下是我在这门课程中的个人心得体会。
首先，在课程的前半部分，我们学习了电子元件的基本原理和特性。
我们通过讲课和实验的方式学习了各种常用的电子元件，如二极管、晶体管、场效应管等。
在实验中，我们学会了如何使用万用表和示波器来测试电子元件的参数，了解了这些元件在电路中的作用和应用。
通过这些实验，我对电子元件的特性和工作原理有了更清晰的认识，为后续的实验打下了坚实的基础。
其次，在课程的后半部分，我们进行了一系列的电路实验。
这些实验涉及到各种不同类型的电路，如放大电路、滤波电路、振荡电路等。
在这些实验中，我们需要设计和搭建电路，然后进行测试和分析。
通过这些实验，我学会了如何根据电路的要求选择合适的元件和搭建电路，同时也提高了我解决问题和调试电路的能力。
在实验中遇到问题时，我会积极思考并尝试不同的解决方法，最终找到合适的解决方案。
除了学术知识和实验能力之外，这门课程还培养了我团队合作和沟通能力。
在实验中，我们通常是以小组的形式进行合作，每个人分工合作，共同完成实验任务。
通过和同学们的合作，我学会了如何有效地分工合作、沟通和协调。
在实验过程中，我们会互相讨论和交流，共同解决问题，这不仅提高了实验效率，也增强了团队合作的能力。
最后，在这门课程的总结阶段，我深刻感受到电子技术的广阔应用和未来的发展潜力。
随着科技的不断发展，电子技术已经渗透到各个领域，成为现代社会不可或缺的一部分。
作为一名学习电子技术的学生，我应该不断学习和提升自己的技能，不断探索和创新，为未来的科技发展做出贡献。
总的来说，这门电路实验课程给我带来了很多收获和启发。
通过学习和实验，我对电子技术有了更深入的了解，提高了实验能力和解决问题的能力，培养了团队合作和沟通能力。
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
化学反应中的链反应机制解析在化学领域中，反应的机制是研究中的一个重要方面。
其中，链反应机制是一种常见的反应机制，在很多化学反应中都发挥着关键作用。
本文旨在对化学反应中的链反应机制进行解析，从而更好地理解和应用于实际。
一、链反应的概述链反应是指在化学反应过程中，反应产生的产物中的一部分能够再次参与反应，从而进一步加速或维持反应进行的过程。
它通常包含三个步骤：起始步骤、传递步骤和终止步骤。
起始步骤是指某种外部能量输入导致某种物质分裂或生成活性基团。
传递步骤是指活性基团在分子间传递，反应物逐步被转化为产物。
终止步骤是指活性基团的消耗，从而终止反应的进行。
二、起始步骤在链反应中，起始步骤通常需要一个外部能量输入，例如光（光解反应）、热（热解反应）或者催化剂等。
这个外部能量可以使某个单质分子分解为两个活性基团，也可以使两个或多个分子发生相互作用，从而生成活性基团。
三、传递步骤在链反应的传递步骤中，活性基团通过分子间传递，使反应物逐步转化为产物。
这个过程通常涉及到自由基或离子的产生和消耗。
自由基是具有单个未配对电子的分子或离子，它们在化学反应中具有相当活泼的反应性。
四、终止步骤终止步骤是链反应的最后一个步骤，它导致活性基团的消耗，从而终止反应的进行。
在终止步骤中，活性基团通常会与其他反应物分子或自由基发生反应，形成不活性的产物。
五、链反应机制的应用链反应机制在化学领域中有着广泛的应用。
它广泛存在于许多重要的化学过程中，例如光化学反应、燃烧反应和聚合反应等。
其中，聚合反应是链反应机制应用最为广泛的领域之一。
聚合反应通过链反应机制将小分子（单体）逐步组装成长链聚合物，从而实现高分子化合物的合成。
六、链反应的控制在实际应用中，如何控制链反应的进行是一个重要的问题。
通过调节反应条件、添加抑制剂或选择合适的催化剂等方式，可以控制链反应的速率和方向，从而实现所需的反应结果。
七、总结链反应机制是化学反应中的一种重要机制，广泛应用于各个领域。
导线连接实习报告心得首先，我要感谢实习单位给予我这次宝贵的导线连接实习机会。
在这段时间里，我学到了很多关于导线连接的知识和技能，也深刻体会到了实践的重要性。
以下是我在实习过程中的一些心得体会。
本次实习的主要目的是让我们了解和掌握导线连接的基本方法、技巧和注意事项。
在实习过程中，我认真观察了师傅们的操作，并亲自进行了实践。
我了解到，导线连接是将两根导线通过一定的方法连接在一起，以保证电流的顺畅传输。
在连接导线时，要确保导线的截面积、材质和绝缘层符合要求，同时要注意连接的牢固度和稳定性。
在实习过程中，我发现了以下几个问题：1. 对导线连接的基本知识掌握不够扎实，导致在实际操作中出现了一些错误。
2. 操作不熟练，影响了连接速度和质量。
3. 对安全注意事项不够重视，存在一定的安全隐患。
针对以上问题，我采取了以下措施进行改进：1. 深入学习导线连接的基本知识和技巧，通过查阅资料和向师傅请教，提高自己的理论水平。
2. 多进行实际操作，通过反复练习，提高自己的操作熟练度。
3. 严格遵守安全规定，确保自己和他人的人身安全。
通过这次实习，我收获了很多：1. 掌握了导线连接的基本方法和技巧，提高了自己的实际操作能力。
2. 学会了如何处理实际操作中遇到的问题，增强了自己的问题解决能力。
3. 深刻认识到安全的重要性，提高了自己的安全意识。
4. 增强了自己的团队合作意识和沟通能力，学会了与他人共同协作，完成任务。
5. 培养了自己的责任心和敬业精神，明白了做好每一项工作的重要性。
总之，这次导线连接实习让我受益匪浅。
我将把在实习中学到的知识和技能运用到今后的学习和工作中，努力提高自己的综合素质，为我国电力事业的发展贡献自己的力量。
质粒构建经验收集2011-03-03 14:04:31| 分类：生物技术| 标签：学习|字号大（1）构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。
为此，构建的质粒克隆载体必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori），最好是松弛型质粒的复制起始位点。
（2）构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并且这样的克隆位点应尽可能多。
作为克隆位点的限制性核酸内切酶的识别序列一般在质粒克隆载体上只有一个。
为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。
（3）构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。
一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。
当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。
常用的选择标记基因，主要有根据克隆子抗药性提高进行筛选的Apr或Ampr 、Cmr或Cmpr 、Kmr或Karnr 、Smr 或Strr、Tcr 或Tetr等抗性基因；有根据克隆子蓝白颜色进行筛选的lacZ'基因。
（4）构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能的小。
由于质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质粒的转化效率高，大于15kb的质粒转化效率明显下降。
质粒克隆载体DNA分子小，意味着可承载较大的外源DNA片段。
（5）根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片段），构建成不同用途的质粒克隆载体。
如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，成为强表达质粒克隆载体；或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个重组质粒是没有问题的。
螺栓联接综合实验心得与建议一、前言螺栓联接是机械工程中常见的一种连接方式，具有简单、可靠、易拆卸和重复使用等特点，广泛应用于各个领域。
为了更好地理解螺栓联接的原理和性能，我们进行了螺栓联接的综合实验。
在实验中，我们通过设计合理的实验方案，选择适当的试验设备和方法，深入研究了螺栓联接的力学性能、失效形式以及影响因素等内容。
在实验过程中，我们不断总结经验、排除故障，最终获得了一些宝贵的心得和建议。
二、实验过程2.1 实验准备在进行螺栓联接实验前，我们首先对实验的目的和要求进行了全面的了解，并进行了充分的准备工作。
具体包括实验设备和试样的准备、实验操作流程的设计、实验数据的处理和分析方法的选择等。
2.2 实验步骤在实验中，我们按照事先设计好的实验步骤进行了实验操作。
首先，我们将试样固定在试验平台上，然后通过加力装置施加不同大小的拉力。
在施加拉力的过程中，我们记录了试样的变形和载荷的变化，并及时调整实验条件，确保实验数据的准确性和可靠性。
2.3 实验数据采集与分析在实验过程中，我们采用了合适的数据采集装置，将试验过程中的数据实时记录下来。
随后，我们对实验数据进行了分析，得出了一些有价值的结论。
同时，我们还通过统计学方法对数据进行处理，计算了一些重要的参数，如拉伸强度、屈服强度等。
2.4 实验结果与讨论根据实验数据和分析结果，我们得出了一些关于螺栓联接的重要结论。
首先，螺栓联接的拉伸性能良好，可以承受较大的拉力。
其次，螺栓联接在较大的载荷作用下会出现塑性变形，同时伴随着载荷的增加，螺栓的失效形式逐渐为断裂。
最后，螺栓联接的力学性能受到许多因素的影响，如螺纹形状、材料性能、预紧力等。
这些结论对于螺栓联接的设计和使用具有重要的指导意义。
三、实验心得3.1 实验设计在实验中，我们设计了合理的实验方案，确定了试验设备和方法，使得实验过程更加顺利。
同时，我们还充分考虑了实验的安全性和可行性，确保了实验操作的简便性和可重复性。
导线连接心得体会
导线连接是一项重要的电工施工工作，对于保障电气设备的安全和稳定运行具有关键性作用。
我通过参与导线连接工作，学到了很多实用经验和体会。
首先，我注意到导线连接的质量和稳定性对于电气设备的正常运行至关重要。
在连接导线时，必须保证导线的连接牢固，接触良好。
缺乏连接牢固会导致电流过大，容易引起短路或火灾等安全事故。
而接触不良则会导致电气设备的故障，甚至无法正常工作。
因此，我在实际操作中，始终坚持选用质量优良的导线材料，并且按照规范要求进行导线连接，确保连接牢固、接触良好。
其次，我发现导线连接的可维护性是一个重要的考虑因素。
导线连接作为电气设备中的关键部件，需要定期检查和维护，以确保其正常运行。
因此，在连接导线时，我会留下足够的接线长度，便于后期检查和维护。
同时，我也会选择标准化的连接方式，便于更换或更修导线。
这样不仅能够提高工作效率，减少维护成本，还能够保证设备的可靠运行。
另外，我认识到导线连接的规范性十分重要。
根据我在实践中的总结，导线连接的规范性主要表现在以下几个方面。
首先，连接导线时要严格按照设计方案进行，遵循电气规范和要求。
其次，连接导线要注意材料的选用，保证其符合电气设备的工作环境和要求。
再次，连接导线时要注意绝缘处理，确保导线之间不发生短路或接触不良。
最后，在连接导线后，需要进行严格的检查和测试，以保证导线连接的可靠性和稳定性。
通过参与导线连接工作，我深刻意识到了导线连接的重要性和规范性。
我将以此为借鉴和指导，提高自己的专业技能水平，更好地完成导线连接工作。
连接点点，让思路清晰心得体会500字
连接点点，让思路清晰。
我深切体会到做任何事情，把各个部分链接起来，就能够让自己的思路清晰，而不是一团糟。
学到新知识时，可以通过先简单理解再加以细化去理解，从而达到融会贯通，让思路更加清晰、系统性。
在完成作业方面，我又能明显感受到连接点点的好处。
有时候作业所讨论的问题，会有许多错综复杂的内容。
如果直接去摸索，脑子里会很混乱，思路很模糊。
但只要把我所看到的部分进行精细的分解，再把其中的连接点仔细连接起来，思路就能够变得清晰，根据整棵树的思路，一切就会变得清晰易懂。
连接点点，不仅仅是学习，在提高思维表达能力、阅读文章体会方面也同样有效。
通过连接点点，不但能够让自己的观点有条理清晰，而且能够让语言表达变得更加流畅有力。
因此，连接点点可以说是种技能，与时俱进的人才所必备的技能，它对于我们在学习上、思考上、表达上都具有十分重要的作用。
关于连接反应的心得
关于连接反应的心得
关于连接反应的心得
最近我在进行转基因载体构建，其中关键步骤包括酶切、酶切片段回收、载体与外源基因A的连接、转化以及重组子的鉴定。
我的工作首先是将基因A（5kb）连接到表达载体B（22kb），然后还要将标记基因（6 -8kb）连到带A的载体上，这其中包括粘末端连接、平端连接、同尾（相同粘性突出端）连接以及双酶切定向连接。
但是我在进行A和B连接时废了1个多月，经高人指点后才连接成功，之后几步连接也相当顺利，经过无数次失败后终于成功，欣喜之余将一点实验心得写下来，供大家参考。
1．关于不同连接方式的效率：
根据载体自连的可能性大小，可以总结出不同连接方式的效率高低，双酶切定向连接>粘末端连接=同尾连接>平端连接。
如果将载体双酶切后的非目的片段去除干净，定向连接将很难自连，而平端连接最容易造成载体自连
2．关于载体和insert的酶切处理：
这是连接反应中最关键的问题之一。
我做的第一步连接失败的原因在于insert（基因A）的处理，基因A 是从一个中间载体（两个SalI 位点）用SalI酶切下来，之后用Bio101（USA）的GEL extraction kit（G lassmilk回收）回收，然后与经XhoI（与SalI同尾）酶切的载体连接，重复了十几次，一直很失败，后来才听人说Glassmilk回收较大片段时容易造成片段降解，同时有可能破坏粘末端，可能国内大部分胶回收KIT回收2kb以上片段时，都会有这种情况。
于是我采用此人建议在酶切中间载体时，除加SalI外，还选用中间载体上非目的片段中特有的酶（基因A中千万不能含此酶，选用该酶可以有效防止载体自连）进行酶切，酶切后不回收只是65C保温15分钟使内切酶变性即进行连接，结果从22个克隆中筛得3个重组子。
尝到甜头后，我在后面的双酶切定向连接中也采用这种处理方法，即对载体进行双酶
切时，选用非目的片段中特有的1-2个酶同时进行酶切，insert也是如此处理，基本上每次连接都取得了好的结果，这种酶切方法最适于双酶切定向连接。
采用这种酶切方法，可以减少切胶回收，。
至于酶切后处理，我对照了65C保温15分钟直接连接与酚仿抽提后乙醇沉淀两种处理方法，效果无明显差异。
而前者省时省力省钱，因此我倾向采用前者
3．关于载体和insert的摩尔比：这是连接反应中另外一个关键问题。
一般连接反应的载体和insert的摩尔比为1：3-10，增加insert 的量主要是减少载体自连，从而提高载体和insert的连接效率。
但是这个比例并非总是如此，关键看载体和insert哪个更容易自连，如果载体和insert都经上述酶切方法处理，1：1连接即可；如果载体相对容易自连，则应增加insert的量；相反，则应增加载体的量4．关于连接条件：一般采用低温（12-22C）连接，但是4C，8C，室温或37C连接也可，低温时连接时间要长（一般8-16小时），高温则需时间较短（20分钟-2小时）。
我一般采用室温连接1-2小时，对于载体构建中所需的重组子个数，这种连接方式足够了。
一些不成熟的实验体会，欢迎指正与讨论
大片断回收还是推荐使用QIAgen 的gel extraction kit 比较好。
并且，直接变性的方法并不见得适用于所有的酶，有些内切酶的buffer
很特别，可能会干扰ligation的。
yoyo,你这加其他酶降解载体的方法很特别！非常有新意。
加100分！
"大片断回收还是推荐使用QIAgen 的 gel extraction kit 比较好"我不赞成，相反，QIAgen 的 gel ext raction kit 容易将片段打断。
chge,你说的“直接变性的方法并不见得适用于所有的酶，有些内切酶的buffer
很特别，可能会干扰ligation的”，我认为有这种可能，但应是极少数的酶会有这种情况，遇到这种情况还可以采用“酚仿抽提后乙醇沉淀”的处理方法，因此我认为并不是很有必要用QIAgen 的gel
extraction kit ，而且从我们实验室使用情况来看，它会造成不同程度的降解。
如果我们能找到更简单、更有效、更廉价的方法，干吗不尝试一下呢？
我现在的试验中遇到的情况和yoyo的类似，但是我的是中间载体和目的insert大小很接近，所以，我一直采用酶切降解载体的方法去除载体，但是我都做gel extraction，一点
没有降解的迹象，从胶上根本看不出来，做连结降解的话不会连结转化的。
楼上诸位，你们讲的降解是如何发现的？
做双酶切比单酶切好多了，我现在是没有办法，载体上都只有一个单酶切位点可用，这已经是非常幸运了，不然只能找切两次的酶作部分酶切，更麻烦。
单酶切只是需要最后酶切鉴定insert在vector上的方向，工作量多一些，其余没有什么。
感谢yoyo的帖子，
2．关于载体和insert的酶切处理中的对载体进行双酶切时，选用非目的片段中特有的1-2个酶同时进行酶切，insert也是如此处理，基本上每次连接都取得了好的结果，这种酶切方法最适于双酶切定向连接。
我在做1301的Ecro1和Hind3酶切时，先选用他们中间的一个酶如我用BamH1切一下，然后用Ecro1和H ind3同时进行双酶切，做载体自连的对比实验（即不加insert，只加载体本身，及igase），先用BamH1切一下，然后用Ecro1和Hind3同时进行双酶切的只长出10个，而直接用Ecro1和Hind3同时进行双酶切的长出了70个之多，
我也不知道为什么它会长70多个，实验室有人说了双酶切定向clone不可能自连的，意思就是说
我的双酶切不完全。
理论上的事我不想管，我只要给我转出我要的clone，嘿嘿，
总之，yoyo的方法在这点上真是太妙了，今天挑了20个白斑，明天提质粒，我想一定会有我要的东西的，先发过帖子谢谢大家先，
特别是yoyo，看了你的帖子后，我一点都不急了，呵呵，同时感谢chge等，嘻嘻，以后还要靠大虾们罩着，保我能按时毕业，
回答yanggerzi的问题,可能太晚了
1. 非目的片断经过酶切处理后，不去除与vector的目的片段自连的概率也很小，所以不影响insert与vector 连接效果
2. 我是直接将连接酶加入酶切液，连接酶缓冲液的量与平常连接相同
3. 我想你现在应该有进展了吧，或者已经做完；如果没有完成，可以说得更详细一点，让大家讨论一下
目的DNA与载体连接需要注意什么？为何连接不上？
我在克隆一个新基因，PCR产物很好，量大而纯。
但酶切连接时却总连接不上，用DH5a也不行。
不知是何原因？请高人指点！
DH5a的转化率应该不错，做过对照吗？确定是连接的原因？
是平端连接还是粘端连接？注意目的DNA与载体的比例、连接温度。
我的实验步骤大抵是这样的：
引物设计---PCR---PCR产物电泳鉴定和KIT分离纯化---纯化产物酶切过夜----电泳和KIT分离纯化---加入载体和连接酶过夜连接---DH5a转化涂板，但板上常常没有东西，或者只有一个点，又不是需要的东西//sigh
你确定感受态没有问题么？对照是一定要做的，连接的对照，转化的对照...
SURE, 我一般是先连T载体, 再连其他的. 这样你可以保证酶切位点的准确(因为有过引物不正确切不动的情况). 另外, 感受态也是一个问题, 最好做个对照.
年前比较急, 我用的是-70度保存的感受态做的, 虽然对照长的很好, 但转化效率非常低, 回来后我新做的感受态, 用的同样的连接产物, 涂了平板, 不要长的太多噢. 你还是要注意注意这个问题.
酶切后的产物回收后有没看看量足不够，
我觉得酶切后直接用乙醇沉淀就好了，小片段是沉不下来的，
步骤越简单越好
还是建议用T载体过渡一下吧,关于这个我被耽误了不少时间.还有胶纯化时候要用好的AGAROSE. 我有两个多月都耽误在这上面了.还一直以为是自己或者课题设计有问题呢.
如果试验不出来的话,重复的时候一定要做连接对照和转化对照了,最好阴性和阳性的都做.
yog和chge说的对，一定要作对照
如果改用T载体连的话，用PROMEGA或TAKARA（大连宝生物）的，其他公司的最好别用。
我碰见的问题正好跟chge相反，用T载体（生工的）连不上，而用PCR产物酶切的却一下就连上了。
PCR产物酶切后怎样用乙醇沉淀的方法得到目的DNA呢？能否把步骤解释清楚一些？本人是新手，非常感谢！
SKYLARK的意思就是直接EtOH2点5倍体积. 如果片段小在加些NaAc, -20度沉淀, 离心, 就OK,
我们还是希望你用T载体先连, 再酶切连到你需要的载体上, 这样哪怕你连接一次不成功, 有菌, 你可以获得大量的目的片段啊 ,就容易一些.
直接连不是不可以, 但有时有些说不清楚的问题, 会影响你的进度
其实酶切产物直接往载体连接可以不做回收
只要加热使酶失活就行了
如果非要回收
可以2V或者更大体积的无水乙醇就可以沉淀了
可以-20"C沉淀10-30min,也可以直接离心15,000rpm,5min
引物没问题，保护碱基都加了。
两者内切酶分别是EcoR 1和Xho 1,保护碱基都加了3个，对Xho 1来说是不是少了点？
另，对于上面建议的乙醇沉淀，不知道沉淀后是否直接用TE或水溶解？
多谢指点！
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