纯化线粒体呼吸控制率RCR定量检测试剂盒产品说明书

线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒说明书50T/24S 可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号:BC1440规格:50T/24S 产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×2支，-20℃保存；临用前每支加入1.11mL 双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；试剂三：液体12mL×1瓶，4℃保存；试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6mL 双蒸水，充分混匀；试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入20mL 双蒸水，充分混匀；试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入20mL 双蒸水，充分混匀；试剂七：液体20mL×1瓶，室温保存。

标准品：液体1mL×1支，4℃保存。

10μmol/mL 磷标准液。

临用前用蒸馏水稀释40倍即0.25μmol/mL 磷标准液。

定磷试剂的配制：按H 2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。

若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

产品说明：线粒体复合体Ⅴ又称F 1F 0-ATP 合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。

该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP 合成，也可逆过程水解ATP。

此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。

复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP 的关键酶。

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

货号：MS3304 规格：100管/48样线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：线粒体复合体Ⅴ又称F1F-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。

该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。

此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。

复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理：复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：80mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：2 mL×1瓶，-20℃保存；试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂五：8mL×1瓶，4℃保存；试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。

若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：①准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

升级版线粒体提取试剂盒C0010描述：线粒体制备试剂盒(Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。

加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。

制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。

严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。

一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。

适用：从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。

组成：Mito Solution100ml for50次制备200ml for100次制备储存：−20ºC12个月有效操作步骤：以下所有操作均在4ºC进行1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。

估计组织块总体积。

加入1.5ml冰预冷的Mito Solution。

用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。

培养细胞匀浆：800×g5min离心收集细胞。

单次提取需2-5×107个细胞。

加入1.5ml冰预冷Mito Solution 重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。

2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。

（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）3.收集上清液并转移到新的离心管。

再次800×g离心5min at4ºC，弃沉淀。

4.将上清液转移到新的离心管。

10,000×g离心10min4ºC。

线粒体沉淀在管底。

离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。

纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂是一种旨在通过极谱法检测系统（polarographic system）测定新鲜活体线粒体在ADP存在（III态呼吸）与否（IV态呼吸）的情况下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

可以被用于线粒体生理功能和药物作用机制等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景线粒体是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心。

电子传递和ATP合成通过质子梯度偶联成一体。

线粒体结构完整，功能正常，底物充分，电子传递形成的质子梯度不断被消耗，电子得以顺畅传递，氧气快速消耗，其耗氧率大，为III态呼吸。

ADP耗竭，质子梯度不能消耗，阻碍电子传递，氧气消耗减少，为IV态呼吸。

呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又称呼吸调节比，是指III态（加入ADP）的呼吸速率与IV态（ADP耗竭）的呼吸速率之比。

正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP 合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。

产品内容介质液（Reagent A）50毫升IV态底物液（Reagent B）400微升III态底物液（Reagent C）400微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备CLARK氧电极仪：用于测定溶解氧浓度实验步骤实验开始前，制备好新鲜的线粒体置于冰槽里备用；同时将－20℃冰箱里的试剂融化，并预热氧电极仪到25℃。

然后进行下列操作。

1．加入2.5毫升介质液（Reagent A）到反应玻璃槽2．使用微型磁力子搅拌，充分混匀3．密封反应槽4．开始记录氧浓度：起始饱和氧浓度值为0.240微摩尔分子氧/毫升（25℃）5．持续记录1分钟后，注射加入20微升待测的线粒体（总量2毫克）（注意：氧浓度可能瞬时变化）6．持续记录1分钟后，注射加入20微升IV态底物液（Reagent B）――开始IV态呼吸（注意：参见注意事项9）7．持续记录2分钟：出现氧浓度缓慢下降8．继续注射加入20微升III态底物液（Reagent C）（注意：氧浓度在10秒钟内开始下滑）――开始III 态呼吸（注意：参见注意事项9）9．持续记录直至出现线性下行斜线出现拐点10．分别测算III态呼吸速率和IV态呼吸速率：氧浓度降低值÷实际时间（分钟）11．计算呼吸控制率：III态呼吸速率÷IV态呼吸速率注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．确保反应玻璃槽洁净，密闭，以免氧气流入4．线粒体样品须新鲜制备，建议不要冻存；制备的线粒体膜须完整，非常重要；建议使用线粒体分离试剂盒－GMS10006.15．注射加入反应槽时，避免气泡和空气注入6．避免乙醇污染；乙醇增加氧浓度；如果底物或抑制剂须使用乙醇溶解，则加注10微升7．保持反应槽温度恒定，温度降低，氧浓度升高8．反应液充分混匀，和环境氧保持平衡9．加注IV态底物液（Reagent B）和III态底物液（Reagent C）前，须充分冻融和混匀10．严格按照规定加注试剂，切莫增加加注试剂容量11．本公司提供系列线粒体检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。

线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。

其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。

产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。

其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。

复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。

基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH －辅酶Q还原酶的特异活性。

超敏C反应蛋白（hs-CRP）测定试剂盒（胶体金免疫层析法）适用范围：用于体外定量检测人血清中的C反应蛋白，与南京美宁康诚生物科技有限公司生产的Mokosensor-A300型胶体金免疫分析仪配套使用。

1.1 包装规格20人份/盒、100人份/盒。

1.2 主要组成成分由相应人份的检测卡、样本稀释液组成，其中，检测卡：检测线包被来源于小鼠的C反应蛋白单克隆抗体A、质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体、金标垫上固定胶体金标记来源于小鼠的C反应蛋白单克隆抗体B。

样本稀释液（1mL）：0.05M PBS缓冲液，pH7.4。

2.1外观2.1.1外观平整，材料附着牢固，内容齐全，包装标签应清晰；2.1.2膜条宽度为4mm±0.2mm；2.1.3液体移行速度应不低于10mm/min。

2.2 净含量液体试剂的净含量不少于标示值。

2.3 空白限不高于0.10mg/L。

2.4 定量限测定0.50mg/L的C反应蛋白样本，变异系数（CV）应不大于10%。

2.5 线性2.5.1试剂盒线性范围为[0.50，100.00] mg/L，线性相关系数r不低于0.9900；2.5.2 [0.50，3.00] mg/L绝对偏差不超过±0.3 mg/L，(3.00,100.00] mg/L线性偏差在±10%范围内。

2.6重复性检测高、低两个浓度的样本,变异系数(CV)应不大于10% 。

2.7准确度测定有证参考物质（编号ERM-DA474：），相对偏差应在±10%范围内。

2.8分析特异性检测浓度为100.00 mg/L降钙素原中超敏C反应蛋白的浓度，计算交叉反应率，应小于10%。

2.9批间差检测一个高浓度的样本，相对偏差应在±10%范围内。

2.10稳定性：常温（10℃～30℃）保存，有效期12个月，有效期末分别检测2.3～2.7项，其结果应符合各项要求。

2.11 校准品溯源性试剂盒校准信息所用校准品按照GB/T 21415-2008 《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，溯源到本公司工作校准品，工作校准品通过国际参考品赋值。

货号: QS3302 规格：25管/24样线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

测定原理：与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：0.5 mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；试剂六：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g，4℃离心5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做）。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。