大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定

吡虫啉对大鼠卵巢颗粒细胞孕酮合成的影响高二二;骆海燕;淡清华;任启语;高小博;陆彩玲【期刊名称】《生殖医学杂志》【年(卷),期】2024(33)5【摘要】目的探究新烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMI)对大鼠卵巢颗粒细胞孕酮合成的影响。

方法使用不同浓度(0、100、200、500、1000μmol/L)的IMI分别处理大鼠卵巢颗粒细胞48 h,收集细胞及细胞培养液上清,电化学发光法检测孕酮和雌二醇(E_(2))水平;Western Blot法检测IMI处理后颗粒细胞孕酮合成关键酶甾体激素合成急性调节蛋白(StAR)的相对表达量;使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002与1000μmol/L IMI共处理颗粒细胞48 h后,收集细胞培养液上清检测孕酮水平。

结果IMI处理大鼠卵巢颗粒细胞48 h,与对照组相比,随着IMI浓度的增加,细胞培养上清液中孕酮水平呈剂量依赖性增加(P<0.05),E_(2)水平无显著变化(P>0.05);Western Blot结果显示,与对照组相比,不同浓度的IMI处理颗粒细胞48 h后,StAR蛋白的相对表达量均显著升高(P<0.01)。

PI3K/AKT通路抑制剂LY294002与1000μmol/L的IMI共处理颗粒细胞48 h后,与对照组相比,LY294002显著降低颗粒细胞基础孕酮的合成水平(P<0.01);与IMI共处理能显著抑制IMI刺激孕酮合成的效果(P<0.001)。

结论IMI影响大鼠卵巢颗粒细胞孕酮的合成,其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

【总页数】6页(P641-646)【作者】高二二;骆海燕;淡清华;任启语;高小博;陆彩玲【作者单位】国家卫生健康委科学技术研究所遗传优生中心;北京协和医学院研究生院【正文语种】中文【中图分类】R994.6【相关文献】1.2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英对大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的影响2.层粘连蛋白对大鼠卵巢排卵前颗粒细胞hCG诱导的孕酮分泌的影响3.层粘连蛋白对大鼠卵巢排卵前颗粒细胞孕酮分泌的影响4.γ-氨基丁酸(GABA)对离体大鼠卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响5.新烟碱类杀虫剂吡虫啉对大鼠卵巢功能的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

补肾健脾方对卵巢颗粒细胞激素水平和细胞周期的影响王海丹;朱萱萱;严士海;王琼;符蕊【期刊名称】《现代中药研究与实践》【年(卷),期】2016(030)002【摘要】目的通过卵巢颗粒细胞原代培养,观察补肾健脾方含药血清对原代培养的卵巢颗粒细胞激素水平和细胞周期的影响.方法采用机械分离法结合胰蛋白酶消化法体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,通过HE染色进行细胞鉴定.采用放免法检测E2的水平,并用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果补肾健脾方含药血清对卵巢颗粒细胞分泌物中的E2水平明显升高,补肾健脾方含药血清大剂量组、中剂量组、小剂量组卵巢颗粒细胞分泌物中的E2水平与空白血清组比较具有显著性差异(P＜0.01,P＜ 0.05).补肾健脾方干预后卵巢颗粒细胞的G2、S期所含的细胞比例有明显的影响,G2期所含的细胞比例明显降低,与正常细胞比较具有显著性差异(P＜0.05),S期所含的细胞比例明显升高,与正常细胞比较具有显著性差异(P＜0.05).结论补肾健脾方含药血清可促进卵巢颗粒细胞由G0期向S期转化,从而促进细胞的增殖.并且具有明显的升高原代培养的卵巢颗粒细胞的E2水平的作用.【总页数】4页(P21-24)【作者】王海丹;朱萱萱;严士海;王琼;符蕊【作者单位】南京中医药大学附属医院江苏省中医院,江苏南京210029;南京中医药大学附属医院江苏省中医院,江苏南京210029;南京中医药大学附属医院江苏省中医院,江苏南京210029;南京中医药大学附属医院江苏省中医院,江苏南京210029;南京中医药大学附属医院江苏省中医院,江苏南京210029【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.促黄体素(LH)对猪卵巢颗粒细胞细胞周期及类固醇激素分泌的影响 [J], 王伟;贺彧;张海燕;田宽校;宋晓光;王晶晶;徐银学2.补肾健脾方对围绝经期及绝经期肥胖妇女体质量及性激素水平的影响 [J], 史志萍;刘霄霞;陆君;李英;卢丽;王静馥;李焕丽;薛有平3.GnRH激动剂对子宫内膜异位症患者卵巢颗粒细胞细胞周期及抗凋亡蛋白cFLIP 表达的影响 [J], 陆湘;李路;吴煜;徐冰;王永卫;伏静;王丽;孙晓溪4.不同浓度补肾健脾方对卵巢颗粒细胞增殖作用的影响 [J], 王海丹;朱萱萱5.育泡饮对大鼠卵巢颗粒细胞增殖及细胞周期的影响 [J], 李楠;刘艳霞;金哲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大鼠卵巢颗粒细胞体外培养及哈蟆油对其增殖功能的影响零小妹;谭焱;季波;杨晶晶;吴新荣;梁磊【摘要】目的采用CCK-8法研究哈蟆油对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,对比分析哈蟆油含药血清对颗粒细胞的最佳作用浓度和时间,为进一步体外试验奠定基础.方法选用25日龄未成年雌性SD大鼠,腹腔注射孕马血清,48 h后脱颈处死,收集卵巢颗粒细胞,在DMEM-F12培养液中培养,并通过HE染色和免疫荧光技术对颗粒细胞进行鉴定.25只SD大鼠分为正常对照组、阳性药对照组、哈蟆油低、中、高剂量组,灌胃给药7d后采血并分离血清.将体积分数为10％,20％,40％,80％各组不同浓度的含药血清加入体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞体系中,采用CCK-8法检测各组24、48 h和72 h细胞增殖情况.结果哈蟆油显著提高了颗粒细胞的增殖能力,有一定的量效和时效关系,随着哈蟆油浓度的增加,其促增殖能力逐渐增强,在作用48 h后,20％浓度体积分数的哈蟆油含药血清组最为显著(P＜0.05).结论体外建立大鼠卵巢颗粒细胞的培养方法,有助于深入研究哈蟆油等中药对卵巢的作用和机制.%Objective To optimize the effective methods ofisolation,purification,culture in vitro and identification of SD rat ovarian granulosa cells,to research the effects of Oviductus Ranae on the proliferation of rat ovarian granulosa cells by CCK-8,and to contrastively analyze the best optimal action concentration and time of serum contsining Oviductus Ranae on granulosa cells to lay the foundation for further in vitro experiment.Methods Nonage SD rats aged 25 d were selected and intraperitoneally injected by pregnant mare serum,then killed after 48 h.Ovarian granulosa cells were collected and cultured in the DMEM-F12 culture solution.The hematoxylin & eosin(HE) staining andimmunofluorescence technique were used to identify the ovarian granulosa cells.Twen ty-five SD rats were randomly divided into the normal control group,positive medicine control group,and low,middle and high do ses Oviductus Ranae groups.Blood was collected and serum was separated after 7 d mediaction gavage.The volume percent of 10 ％,20％,40％,80％serum in each group was added into the in vitro medium system of ovarian granulosa cells culture.Then the cell proliferation situation at24,48,72 h in each group was measured by CCK-8.Results Oviductus Ranae significantly increased the proliferation ability of granulosa cells in a certain dose-dependent relation.With the increase of Oviductus Ranae concentration con centration,its.proliferation ability was gradually increased,after 48 h action,which in the Oviducthus Ranae-Comtaining serum group with the volume fraction of 20％ was most significant (P＜0.05).Conclusion Establishing in vitro cultural method of rat o varian granulosa cells is conductive to further research the action and mechanism of Oviductus Ranae on ovary.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2017(046)013【总页数】5页(P1792-1796)【关键词】哈蟆油;卵巢颗粒细胞;增殖;含药血清;CCK-8【作者】零小妹;谭焱;季波;杨晶晶;吴新荣;梁磊【作者单位】广东药科大学中药学院,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广州军区广州总医院干部病房一科,广州510010;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学中药学院,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学中药学院,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010【正文语种】中文【中图分类】R711女性进入围绝经期卵巢功能衰退可能导致多种疾病发生[1]。

FSH抑制大鼠卵泡颗粒细胞Hippo信号通路促进雌激素合成陈泰任;吴梦静;董玉婷;孔斌;蔡玉芳;黑常春;吴凯;赵承军;常青【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2022(44)6【摘要】目的研究卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)是否通过Hippo信号通路促进大鼠卵泡颗粒细胞芳香化酶(CYP19A1)的表达和雌激素合成。

方法体外分离培养大鼠原代培养卵泡颗粒细胞(GCs)24 h后,HE染色和免疫荧光法观察GCs生长情况和纯度。

随后将GCs分为4组:对照组(无干预)、FSH组(0.3 IU·mL^(-1))、VP组(10μg·mL^(-1) Verteporfin,YAP的特异性抑制剂)、VP+FSH组(0.3 IU·mL^(-1) FSH+10μg·mL^(-1) Verteporfin),继续干预24 h。

通过Western blot观察Hippo信号通路关键因子LATS1、P-LATS1、YAP、P-YAP和CYP19A1在GCs中的表达情况。

采用ELISA测定GCs的雌二醇(estradiol,E2)浓度。

结果Western blot结果显示,FSH可以促进GCs中LATS1、YAP和CYP19A1的表达,VP可抑制LATS1、YAP和CYP19A1的表达;在VP+FSH组中,LATS1、YAP和CYP19A1的表达较FSH组低,较VP组高(P均<0.05)。

ELISA结果显示,FSH组E2浓度升高,VP组E2浓度降低,VP+FSH组的E2浓度较FSH组降低,较VP组升高(P均<0.05)。

结论FSH通过抑制大鼠卵泡GCs的Hippo信号通路,促进CYP19A1的表达与雌激素的合成。

【总页数】5页(P580-583)【作者】陈泰任;吴梦静;董玉婷;孔斌;蔡玉芳;黑常春;吴凯;赵承军;常青【作者单位】宁夏医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系;宁夏生殖与遗传重点实验室;生育力保持教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R714.13【相关文献】1.卵泡刺激素促进卵巢颗粒细胞增殖分化的信号通路的研究进展2.FSH及Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的增殖及雌激素分泌的影响3.Interleukin-1β对促卵泡生成素(FSH)诱导大鼠颗粒细胞雌激素生成的抑制作用4.转铁蛋白抑制大鼠卵泡颗粒细胞FSH受体的结合与维持5.转铁蛋白抑制FSH刺激大鼠卵泡颗粒细胞分化的细胞内主要机制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。

体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。

其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。

目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。

非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。

近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。

心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。

腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。

C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。

CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。

转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。

剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。

使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。

使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。

培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。

2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。

离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。

采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。

四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。

纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。

（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。