香樟Actin基因的克隆及表达分析
- 格式：pdf
- 大小：2.47 MB
- 文档页数：8
的［1］ 。在植物基因的表达分析研究中比较常用的内 参 基 因 是 看 家 基 因（house-keeping gene） ，因为看 家基因的表达水平受环境影响较小，主要包括肌动 蛋白基因（ACT） 、甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（G3PDH/ 、18S 和 28S 核糖体 RNA 基因（18S rRNA、 GAPDH）
［18］ ［17］
因片段，并用 Q-PCR 技术对 CcACTc Байду номын сангаас因进行表达 分析，研究其在香樟不同器官中以及低温处理条件 下的稳定性，旨在为开展香樟优良内参基因的筛选 提供参考。
1
1.1
材料与方法
材料
材料 试验材料为本实验室保存的香樟无性
1.1.1
系组培苗，继代培养基为 MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L 2， 4-D，生根培养基为 MS 基本培养基，其中蔗糖 30 g/L，琼脂粉 8.0 g/L，培养温度（25±1） ℃，光照强 度 2 500 lx，光照时间 16 h/d。待材料在 MS 基本培 养基上生长至有 5-7 片叶片时，开始对材料进行低 温处理，处理温度为 4℃，分别于 0、0.5、1、2、4、 6、12、24、48 和 72 h 随机取叶片 ； 同时选取生根 良好且长势一致的健壮组培苗，取其根、茎、叶片。 所有的材料平行取 4 个重复，收获后立即用液氮速 冻，-80℃保存直至 RNA 提取。 1.1.2 主要试剂与仪器 大肠杆菌感受态 Trans5α、 EasyTaq DNA 聚合酶、TransTaq-T DNA 聚合酶购自 北京全式金（Transgen）生物技术有限公司 ； Premix ExTaq DNA 聚 合 酶、primeSTAR GXL DNA 聚 合 酶、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、DL2000 DNA Marker、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit 购 自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司 ； CTAB 植 物基因组 DNA 快速提取试剂盒、EASYspin Plus 植 物 RNA 快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂 盒购自北京艾德莱（Aidlab）生物科技有限公司 ； 0.2 mL EU 材质薄壁 8 连管购自荷兰 Bioplastics 公司 ； RT-qPCR 反应试剂为 FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）购自瑞士罗氏（Roche）公司 ； 其他 生化试剂采用国产或者进口分析纯。荧光定量 PCR 仪为美国伯乐（Bio-Rad）公司生产的 CFX-96 实时 荧光定量系统。 1.1.3 引物设计 通 过 比 对 GenBank 中 已 公 布 的 其 他 植 物 Actin 基 因 cDNA 序 列， 根 据 保 守 区 域 利 用 Primer5.0 软 件 设 计 一 对 简 并 引 物 CcAct-F 和 CcAct-R， 预 测 所 得 片 段 长 度 约 1 000 bp ；根 据 CcACTc 基因核苷酸序列的特异区域设计一对 Q-PCR 引 物 CcAct-RTF 和 CcAct-RTR， 扩 增 片 段 373 bp。
2015,31(5)
李勇鹏等 ： 香樟 Actin 基因的克隆及表达分析
121
28S rRNA）及肽链伸因子（EF1a）基因等［2］ 。其中 Actin 是一个比较常用的内参基因，该基因在真核细 胞中普遍存在，并且编码一类高度保守的蛋白，所 编码蛋白是细胞骨架的基本组成成分之一，参与许 多重要的亚细胞进程，诸如细胞分裂与伸长、胞吞 作用、细胞信号转导、重力感应、极性生长、细胞 器运动和程序性细胞死亡等，因此在植物发育和形 态发生中发挥重要作用［3-6］ 。在肌动蛋白结合蛋白 （Actin-binding protein）的作用下，肌动蛋白微丝的 长度、极性、稳定性和三维结构不断变化［7，8］ 。自 从 1963 年，Yan 和 Shi 第一次证明高等植物中存在 肌动蛋白 Actin，研究者们已经相继从多种高等植 物中获得 Actin 基因，如玉兰、枣树、木薯、芍药、 豌豆和荔波连蕊茶等［9-15］ 。然而，还有许多物种的 Actin 基因有待分离和鉴定，以便作为内参对该物种 其它基因进行定量分析。 香樟（Cinnamomum camphora） ，又名樟树、乌 樟，樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum） ，属常 绿乔木，含有特殊香气和挥发油，是贵重家具、高 级建筑、造船和雕刻等的理想用材。近年来，香樟 在园林绿化中的应用越来越多，正成为城市中重要 的园林绿化树种［16］ 。香樟主要分布于长江以南及西 南地区，近几年黄河流域也有分布。低温胁迫是限 制香樟的地理分布及其在园林绿化中应用的一个重 要环境因子。因此，培育香樟抗寒新品种有利于其 在冬季寒冷的北方地区推广。研究抗寒相关基因， 从而利用基因工程技术获得香樟抗寒新品种，具有 目的性强、方便快捷等优点，是香樟新品种改良的 有效途径。香樟抗寒相关基因的表达模式研究需要 一个在低温条件下表达量相对恒定的内参，进行实 时荧光定量 PCR 分析。Actin 基因被证明在一些逆境 胁迫条件下表达量相对恒定 如 Peng 等
Cloning and Expression Analysis of Actin Gene in Cinnamomum camphora
（School of Life Science and Technology，Nangyang Normal University，Nanyang 473000） Abstract: As a house-keeping gene, Actin has been always being used as an internal standard to normalize mRNA levels between different samples by quantitative real-time PCR, thus plays an important role in gene expression analysis. In this research, through a method of homology cloning, a pair of degenerate primers were designed based on the conserved sequences of Actin genes from other plants submitted to GenBank, and then 4 cDNA fragments from Cinnamomum camphora were obtained using RT-PCR. Molecular biological analysis showed that, each of the 4 cDNA fragments was 998 bp and encoded a putative protein of 332 amino acids. Moreover, according to the homology analysis, the 4 cDNA fragments belonged to Actin subfamily, and they were named CcACTa, CcACTb, CcACTc and CcACTd, and deposited in GenBank （Accession number ： KM086736 KM086737 KM086738 and KM086739）. Quantitative real-time PCR results revealed that the expression level of CcACTc in different organs such as root, stem, leaf and leaves under low temperature treaments was relatively stable. It could serve as a candidate reference gene. Key words: gene cloing ； expression analysis ； quantitative real-time PCR Cinnamomum camphora ； Actin ；
收稿日期 ： 2014-10-15 基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目（31100511） ，河南省高校青年骨干教师计划资助项目（2010GGJS-161） ，南阳师范学院博士科研启 动资助项目（nynu200746） ，2015 年度研究生创新基金项目（2015CX008） 作者简介 ： 李勇鹏，男，硕士研究生，研究方向 ： 园林植物遗传育种 ； E-mail ： daniel_lee1217@ 通讯作者 ： 杜丽，女，博士，副教授，研究方向 ： 园林植物遗传育种 ； E-mail ： dldldlucky@
122
生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2015,Vol.31,No.5
实验所用引物信息，见表 1。
表1
引物名称 CcAct-F CcAct-R CcAct-RTF CcAct-RTR M13-F M13-R
Li Yongpeng Zhang Liwei Yao Yao Huang Rui Du Li
半 定 量 PCR（Semi-quantitative RT-PCR） 和 实 时 定 量 PCR（quantitative real-time PCR） 即 Q-PCR 是对来自不同组织的 mRNA 进行定量的有效方法， 内参基因可以矫正样品之间的差异，因此对于上 述两种分析方法选择合适的内参基因是非常必要
，也经常作为内参应
用于植物抗寒相关基因 DREB 家族基因的表达分析。 在研究羊草 DREB 基因转拟南芥的表
［19］
达分析时以拟南芥 Actin 作为内参 ；张勇等
在
研究草莓 FaCBF1 基因的表达分析时也运用了 Actin 基因作为内参。本实验室已经从香樟中分离到两个 ，优先选择 Actin 基 DREB1/CBF 基因（数据未公布） 因作为内参，然而，迄今为止关于香樟 Actin 基因的 研究还未见报道。本研究首次从香樟中克隆 Actin 基
